摘要：本文以EGFR激酶共价抑制剂Afatinib为例，描述了如何用SPARK的共价药效团特征进行共价抑制剂弹头的结构替换（跃迁）。
一. 前言
之前在《Ligandscout案例 | 共价键结合药物的虚拟筛选》介绍过利用Ligandscout的共价药效团特征可以进行共价抑制剂的药效团识别与虚拟筛选，在该文中，Schulz R等人(2018 JMC)采用基于结构的方法识别了3C蛋白酶(3C Protease)共价键结合的3D药效团模型，对一个3000个化合物的数据库进行虚拟筛选发现3C蛋白酶共价键结合的不可逆抑制剂，最后通过骨架跃迁、结构优化发现了化学稳定的共价抑制剂。
SPARK的药效团约束也包含Covalent元素，因此也可以利用这个药效团元素进行共价抑制剂弹头的骨架跃迁。本文以EGFR激酶抑制剂Afatinib为例，演示如何对共价抑制剂的弹头（Warhead）进行片段替换。
二. 操作步骤
1. 起始化合物与弹头
起始化合物为EGFR抑制剂Afatinib（图1），其与EGFR Kinase的复合物结构可以从PDB 4G5J获取。从4G5J复合物结构可以发现Afatinib通过黄色高亮标记的那个C原子（图1）与蛋白的巯基共价结合。本文的目标是：用SPARK骨架跃迁技术发现可以替换图1阴影覆盖的片段、并具有共价结合的能力。
图1. 起始化合物Afatinib以及替换区域（阴影）、共价结合的位点（黄色）
2. 共价结合的骨架跃迁
流程与方法同普通的骨架跃迁、大环化分子设计一样，参见《SPARK–骨架跃迁视频教程》：先选中替换区域（图2），点Next，直到替换参数设置完成。
图2. 替换区域的选择
到了Set Constrains步骤，点击Pharmacophore下的Add按钮（见图3步骤1）。再用鼠标点击图1黄色高亮的双键碳原子以表明此处应该有原子与蛋白发生共价作用。在弹出的Pharmacophore constraint对话框里将Covalent勾选（图3步骤2），再点击OK（图3步骤3）。
图3. 添加药效团约束
至此，共价片段的替换已经设置完毕。其它的数据库选择等等参数与普通骨架跃迁没有区别。这里我只选择了ChEMBL Common与very common两个片段库进行片段替换。
3. 部分结果展示
起始化合物的F取代衍生物（图4）被骨架跃迁设计出来，打分排名第三。SPARK可以追溯替换片段来源，可以发现该含F的片段来自化合物CHEMBL3357650（见图5）。
图4. Afatinib的F取代衍生物（左：起始化合物Afatinib，右：设计的化合物）
图5. Afatinib氟取代衍生物的片段来源自CHEMBL3357650
起始化合物Afatinib自身也被设计出来，排名第4。替换片段来自CHEMBL360979（图6）。
图6. Afatinib自身被设计出来，片段源自CHEMBL360979
SPARK的骨架跃迁还设计出吗啉环取代的迈克尔加成片段，如图7所示，打分相当高。有兴趣的小伙伴们不妨试试。
图7. 吗啉取代的迈克尔加成片段化合物
三. 小结
在这个实验里，SPARK设计了500个（预设值500）新的化合物，其中包含了部分已知的EGFR共价抑制剂或其衍生物。这说明SPARK的共价药效团约束可以实现共价抑制剂的弹头骨架跃迁、发现新的共价抑制剂弹头（Warhead）。
