摘要：本文介绍了Spark新发布的具有实验数据支持的、包含已知的和商业可供购买的降解剂连接臂数据库。本文以异双功能降解剂分子AK-2292为例，演示了如何用新数据库对其连接臂进行生物等排体替换实验。结果表明，在Spark打分靠前的结果中包含了文献报道的10个连接臂中的8个，其中7个排名位于前250个结果中；实验活性第3的降解剂（化合物27）在前1000个结果中排名第7。相反，如果用常规的片段数据库进行Spark生物等排体替换实验，则只能在结果中重现出文献报道的10个连接臂中的2个。这说明了新发布的连接臂数据库是异双功能降解剂连接臂设计非常有前景的工具。

作者：Jessica Plescia/2024-05-14
编译：肖高铿

异双功能分子在靶向蛋白质降解中的作用是什么？

异双功能分子或降解剂广泛用于靶向蛋白质降解（targeted protein degradation，TPD）。这些分子系统通常由（1）靶向泛素连接酶的配体，（2）靶向目标蛋白质的配体，和（3）连接它们的连接臂组成。通过该系统，可以将感兴趣的蛋白质靶向降解并引导至相应的蛋白酶体。然后回收异双功能分子^1,2。图1描述了蛋白质相对于降解剂的降解过程。

图1. 蛋白质水解循环、异双功能降解剂的再循环和靶标蛋白的泛素化。本图部分使用施维雅医学艺术(Servier Medical Art)生成，由施维雅(Servier)提供，CC by 4.0许可协议(CC by 4.0 Deed | Attribution 4.0 International | Creative Commons)授权。

异双功能降解剂的优点与挑战

最近TPD研究的复苏可归因于与小分子药物发现相比的几个优势。首先，许多生物靶标，特别是癌症靶标，对小分子抑制剂或拮抗剂产生耐药性。然而，各自的降解剂已经显示出对几种抑制剂耐药癌症株的有效性。

此外，由于小分子药物的简单性和尺寸小，它们经常会引起脱靶毒性，无论是已知的还是特异性的。异双功能分子的优点是它们的复杂性增加了它们的选择性并限制了它们与已知脱靶的结合。

小分子通常也需要对其生物靶标具有很高的亲和力，如果它们不包含不可逆结合的弹头，则在靶标活性位点的停留时间可能很短。然而，异双功能降解剂可以容忍较低的结合亲和力，并表现出与其蛋白质靶标持续的结合。

然而，由于异双功能降解剂的尺寸与复杂性，使得设计变得相当具有挑战性。例如，优化物理和化学性质是一个比小分子复杂得多的过程。其复杂性的另一个缺点是它们相关的耐药机制。如果蛋白质靶标对小分子产生耐药性，则通常是活性位点的单点突变。但是，由于这些异双功能分子要复杂得多，因此很难确定生物耐药性的机制。这些挑战需要简化异双功能降解剂的设计和研究的方法。

连接臂的设计：一个示例

为了应对连接臂设计的挑战，已经创建了新的片段数据库，可在Spark中用于生物等排替代或配体连接实验。这些数据库从侯廷军课题组的PROTAC-DB库⁴以及Enamine Linkers for Linkerology⁵的“Stock”和“Made”子集准备而来。本文将以Kaneshige A.等人⁶报道的异双功能分子AK-2292为例来说明如何使用这些数据库。如图2所示，该异双功能分子由STAT5结合剂、CRBN结合剂和一个小连接臂组成。

图2. Kaneshige A等人⁶报道的异双功能分子AK-2292。2D与3D图中的连接臂用蓝色高亮，PDB 7TVA

在作者的研究中，实验测试了一系列不同长度与刚性程度的酰胺连接臂。表1列出了这些连接臂以及相关降解剂的半数最大降解浓度（half-maximal degradation concentration），DC₅₀。

表1. Kaneshige A等人⁶报道的不同连接臂降解剂的活性。AK-2292（化合物30）的连接臂以蓝色显示。

作者专注的连接臂一端安装有脱水偶联反应的仲酰胺或叔酰胺，另一端是使用Sonogashira交叉偶联安装的sp杂化碳以产生内炔烃（一个包括酰胺/苯胺组合的例子）。为了使Spark实验与文献报答的实验一致，我们以蛋白共晶结构PDB 7TVA里的异双功能降解剂分子为起始分子。我们将连接臂片段作为要被替换的骨架，而不是传统的骨架跃迁实验。为了与化学偏好保持一致，原子类型偏好相应地进行改变。图3突出显示了Spark实验。

图3. 左：AK-2292的骨架跃迁实验界面。连接臂片段高亮显示，表明它是要被生物等排体连接臂替换的部分。左上角高亮显示了选定的原子类型。连接点1（酰胺）设置为任意氮，而连接点2（炔烃碳）设置为任意氮或sp杂化碳。右：起始分子AK-2292在3D视窗中的Cresset场点⁷，连接臂片段高亮显示，表明它是要被生物等排体连接臂替换的部分。

由于这种异双功能分子比Spark骨架跃迁实验中通常使用的小分子大得多，因此还调整了高级设置里的距离和角度以允许未改变部分发生一些移动。RMSD距离设置从0.75Å更改为2Å，角度设置从15°更改为45°。允许的可旋转键的数量也增加到10个以包括更加柔性的连接臂。

骨架跃迁实验首次使用了新的连接臂（Linker）数据库。有了这些数据库，在Spark生物等排体替换实验打分靠前的结果中包含了研究报道的10个连接臂中的8个，其中7个排名位于前250个结果中（见表1）。更有希望的是，实验活性第3的降解剂化合物27在前1000个结果中排名第7位。这些结果如图4所示。

图4. 在Spark实验中使用新的连接臂数据库，结果包含了文献报道的连接臂。Spark平铺结果视图显示了与起始分子AK-2292连接臂相似的生物等排体替换结果。AK-2292的活性以蓝色显示。



实际上，没被Spark发现的两个连接臂是环酰胺31和32，它们都显示出非常低的降解活性。在前50个Spark结果中发现了三个亚微摩尔活性的结果，这表明Spark不仅可以找到有前途的生物等排体，而且可以优先考虑具有理想活性的连接臂。连接臂29具有负的BIF%或生物等排因子：正的BIF%值表示有利的生物等排，而负值反映了可以再现原始分子几何形状但不是缺失部分好的模拟物。预计该结果也是活性较低的连接臂之一。Spark实验的前10个结果如图5所示。这些结果在结构上与表1报道的连接臂非常相似，具有不同的链长和刚性酰胺。然而，一些结果还含有刚性的环酰胺，这可能会降低整个分子的活性，尽管这仍有待实验证实。

图5. Spark实验打分最高的10个结果，包括文献报道的化合物27（排名第7），显示了活性值。

这些实验结果非常有希望用于连接臂的设计，因为它们保持了起始连接臂所需的形状和静电，同时还包含了有前景的小变化，例如引入醚或立体化学中心。图6显示了Spark实验靠前的5个结果与AK-2292连接臂，以及它们的正、负分子静电相互作用势⁷。我们可以看到，尽管有一些结构变化，但总体静电势与起始连接臂的静电势非常相似。换句话说，它们是有前景的生物等排体。

有了这些新信息，连接臂数据库还可以用于Spark配体连接实验以探索靶向目标蛋白质的配体与靶向E3连接酶的配体之间尚未有人涉足的空白区。

图6. AK-2292与打分最高的5个结果的静电相互作用势⁷，其中桔黄色高亮的部分为连接臂区域。

为了进一步证实这种新的连接臂集中库的有用性，我们使用现成的Spark VeryCommon和Common数据库（源自商业化合物的片段）以及ChEMBL_Common数据库（来自文献报道分子的片段）重复了实验。尽管在商业和ChEMBL数据库中搜索了超过16.1万个片段，而在连接臂数据库中只有9672个片段可用，但这次搜索的结果远没有那么有希望，因为文献报道的10个连接臂中只有2个被发现。这些结果也显示在表1中。

第二个实验的结果证实，现有Spark数据库中已知的降解剂连接臂较少，因为这数据库通常包括不适合连接臂设计的更小，更刚性的片段。相反，异双功能分子连接臂专用的新连接臂数据库是计算方法设计连接臂非常有前途的工具。

结论

在本文中，我们探索了Spark骨架跃迁实验在异双功能分子中的应用。我们已经看到，新的连接臂库全面包含了具有实验数据支持的已知的和商业可供购买的降解剂连接臂，因此是异双功能降解剂连接臂设计非常有前景的工具。

参考文献

1. Li, F. et al. Nat Commun 2022, 13, 7133
2. Xie, H. et al. Explor Target Antitumor Ther. 2021, 2(6), 511–521
3. New Spark™ 'Linkers' databases to address the challenge of linker design
4. http://cadd.zju.edu.cn/protacdb/
5. https://enamine.net/building-blocks-mob/linkers-for-linkerology
6. Kaneshige, A. et al. J Med Chem 2023, 66, 4, 2717–2743
7. https://www.cresset-group.com/science/overview/

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