摘要：膜蛋白是一种难以初始化和建模的生物学体系。Flare中的分子动力学可以推演分子体系如何随时间进化，可用于探索分子体系的构型空间，从而深入了解构象稳定性和原子机制。在本文中，我们讨论了如何在Flare中配置、执行和分析膜蛋白MD模拟。在评估膜蛋白MD模拟的稳定性和准确性时，我们特别强调了需要注意的关键症状。

前言

Flare中的分子动力学（MD）演示了分子体系如何随时间进化。它可用于探索分子体系的构型空间，从而深入了解构象稳定性和原子机制。MD的适用范围包括可溶性蛋白质，在Flare中，MD可以无缝地应用于膜蛋白的研究，膜蛋白是一种通常难以初始化和建模的生物学体系。

在本文中，我们将展示如何在Flare中轻松配置，执行和分析膜蛋白的MD模拟。

获取正确取向的膜蛋白靶标

建立膜-蛋白质体系的第一个关键步骤是获得相对于模型膜双层的正确方向和位置的蛋白质结构。只有这样，才能围绕蛋白质构建所选的双层膜模型、跑MD模拟（图1）。

图1. Flare搭建膜蛋白模拟的工作流

可以直接通过Flare的PDB下载器从蛋白质在膜上的取向数据库（Orientations of Proteins in Membranes，OPM）中下载相对于膜具有正确方向的蛋白质。使用的时候，需要去掉指向OPM数据库的URL路径前的注释符号“#”，而在指向蛋白质数据库的URL路径前加上注释符合“#”，迫使Flare仅从OPM数据库下载蛋白质（图2）。一旦导入，Flare可以准备蛋白结构、修复任何妨碍MD模拟运行的结构问题。

图2. 从OPM数据库下载相对于其母体膜具有正确取向的蛋白结构

通过从OPM数据库下载蛋白质，确保准备的蛋白结构存在于相对于膜的正确坐标框架内。可以理解的是，如果OPM数据库中不存在您所需的蛋白，则可以使用Flare下载其同源蛋白，从中可以进行序列比对并将结构叠合到其上。这会将你的蛋白质定位到膜中。

膜的搭建以及膜蛋白的分子动力学模拟

Flare将在设置和运行MD模拟的过程中为您准备的膜蛋白构建脂质双层。在动力学计算窗口中，您选择使用OpenFF with membrane运行计算（图2）。这将为配体应用OpenFF 2.0小分子力场，为蛋白质应用AmBERF14SB力场，还可以选择POPC或POPE脂质双层。在图3中，脂质双层占据的垂直空间显示为蓝色长方体。。

图3. 在预配置步骤中构建脂质双层并运行膜蛋白MD模拟。

与任何MD模拟一样，您可以选择延长或缩短模拟时间，计算自定义配体扭转角参数，并在模拟的平衡阶段进行GCNCMC水采样。此外，在“显示选项”对话框中，您可以自由增加MD模拟的平衡时间，这对于需要更长时间才能稳定的非常大的蛋白质-脂质双层体系可能是必要的。

分析您的膜蛋白动力学模拟

Flare提供了一套大型MD分析工具，使用户能够彻底分析模拟。最值得注意的是，Flare可以计算蛋白的RMSD、RMSF和回转半径随时间的变化，从而深入了解蛋白质嵌入脂质层中的构象稳定性。这些视觉分析工具有助于解释蛋白质的功能和行为，有助于理解并在观看最终模拟和实时查看构象动力学时提供更深入的见解（图4）。

图4. 靶标体系构象动力学的可视化、结构化分析

脂质双层的结构特征在模拟过程中应保持稳定。特别是，蛋白质和脂质双层应该在模拟过程中发生有利的相互作用，不呈现任何膜塌陷的证据，并且证明膜中心在Z轴（垂直于膜平面的轴）上的位置是保守的。需要注意的是，不稳定膜蛋白模拟的典型症状包括：

(1) 在膜和脂质之间产生大的开口

蛋白质和脂质之间的稳定接触应该使它们之间的距离随着时间的推移保持稳定。如果脂质在模拟过程中远离蛋白质，产生一个大的开口，这表明蛋白质可能沿着Z轴不准确地插入膜中。为了在Flare中测试这个问题，可以将脂质的显示方式更改为CPK，沿着Z轴定位体系，并重新观察轨迹，寻找围绕蛋白质产生的大开口（图5）。当可疑现象出现时，可以使用Flare的测量选项来跟踪原子之间的距离，特别是跟踪随时间变化的任意两个（用户定义的）原子之间的距离。

图5. 将脂质显示样式更改为CPK，并重新观察模拟以检查脂质和蛋白质之间的距离随时间的变化。

(2) 凝胶化（Gelification）

脂质双层的烃链本质上是柔性的，并且应该在模拟过程中能够证明这种柔性。冻结的烃链在动态轨迹上没有运动，被称为“凝胶化”。此事件通常是由于力场参数化不佳引起的。这样做的结果是，你的膜是非物理刚性的，因此你失去了对体系真实构型空间进行采样的信心。通过目视检查膜蛋白MD轨迹可以很容易地发现这一点。

(3)起伏不定与包膜打开

这是指在整个模拟过程中观察到脂质双层发生弯曲，通常意味着模拟盒子太小和/或模拟压力太高（图6）。与上一点类似，这会导致生物物理构象不具有代表性，从而降低膜蛋白模拟的准确性和可解释性。自然，这一点的延伸是观察脂质双层包膜在周期性边界处的开放。与图6相反，这触发了在蛋白质嵌入的Z轴中心形成凹曲率。

图6. 脂质双层的起伏不定。该图部分是使用Servier提供的Servier Medical Art生成的，根据CC-BY-4.0许可证获得许可。

结论

在本文中，我们讨论了如何在Flare中配置、执行和分析膜蛋白MD模拟。在评估膜蛋白MD模拟的稳定性和准确性时，我们特别强调了需要注意的关键症状。

有关Flare分子动力学环境、工作流和分析工具的可视化演示，请观看我们的网络研讨会录像回放。

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