用Flare FEP计算预测HPK1抑制剂的结合自由能

摘要：HPK1作为一种靶标，其特征在于结合口袋具有较高的构象柔性，并涉及到溶剂化作用的影响，这为使用自由能微扰（FEP）方法预测其抑制剂的结合自由能带来了挑战。本文阐述了如何运用CADD平台Flare中的一系列工具来执行蛋白质结构准备、水分析、分子动力学模拟以及配体叠合等步骤，从而为体系进行充分的前期准备。通过这些准备工作，我们能够在FEP基准测试计算中取得令人满意的结果。

作者：Federico Issoglio & Stuart Firth-Clark. Cresset, Cambridgeshire, UK.
编译：肖高铿/2025-01-09

前言

本研究展示了一次相对结合自由能（RBFE）计算，包括一组28个与HPK1结合的化合物¹。HPK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于STE20家族的一员。由于它负向调控T细胞抗原受体的激活信号，并且其激酶活性在这个过程中起着关键作用，因此HPK1是癌症和传染病治疗中的一个令人感兴趣的靶标。

人们已经确认，在溶液中，HPK1激酶域（HPK1-KD）的激活段涉及单体和二聚体之间的平衡，而二聚体通过结构域交换构象在活性/非活性状态之间交替²。

对于这种结构柔性的蛋白靶标，为了从自由能微扰（FEP）计算中获得准确的预测，对受体和配体进行仔细准备是必不可少的。利用Flare中的各种工具，设计了一个全面的工作流来选择和准备受体，生成配体同系物系列的紧密叠合，并创建用于后续FEP计算的连接图。

图1. Flare FEP图形界面，包括FEP结果分析工具与故障排除工具（比如扭转角图，收敛图与叠合矩阵等）。

方法

每一个步骤都使用了计算机辅助药物设计（CADD）平台Flare，包括蛋白质和配体的准备、水分析、分子动力学模拟、配体叠合和自由能微扰（FEP）计算等。

受体准备

口袋分析和3D-RISM被用于评估溶剂可及性，并生成结合位点溶剂化缺失的信息，利用现有的实验数据来证实和验证这些预测。

分子动力学模拟

200 ns production runs: 7M0K, 7M0L, 7M0M.
Protein forcefield: Amber ff14SB
Small molecule forcefield: OpenFF 2.2.0
Charge method: AM1-BCC
Water model: TIP3P, 在平衡阶段使用GCNCMC协议

配体叠合

Method: 用最大公共子结构（MCS）方法进行同系物的叠合
Reference：在第1轮中用共晶配体，在第2轮中用打分最高的结果
Refinement: 利用静电互补性（EC）和场点信息来指导叠合地优化

Flare FEP

参数：同分子动力学模拟准备阶段
每个λ窗口模拟时长：初始设为4ns，需要更长时间采样的链路可增加至最高15ns。
相空间重叠不足的情况下，会额外计算超出自适应λ调度所定义的λ窗口数量（最小值=9）。

结果

受体准备

迄今为止报道的27个蛋白结构揭示了HPK1-KD（HPK1激酶域）具有高度的构象可塑性，这涉及到包含催化结构域与DFG所在的激活环（A-loop）。这种异质性反映在含有共结晶参比分子的三个PDB结构中。通过口袋分析和使用3D-RISM进行的水分析得到的结果表明，对活性位点处水网络的适当描述是至关重要的。

图2. A) HPK1 (PDB 7M0K) 的飘带图表示，包括一个内嵌的放大图，显示了链A的活性位点（链B以青色显示，来自链A的A-loop以红色显示），并展示了DFG中的D155和F156的相对位置（化合物#1以绿色棍状模型显示）。B-D) 分别为PDB 7M0K、7M0M和7M0M中共晶化合物的二维结构表示，分别为化合物#1、#6和#27。

分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulations）

使用Flare的Dynamics模块评估了复合物的构象稳定性。在蛋白质准备过程中可知，结合位点的溶剂化对于获得良好的预测可能至关重要。因此，在分子动力学模拟（MDs）的平衡步骤期间采用了GCNCMC协议，以改善活性位点处水分子的采样。结合使用Flare图形用户界面上的MD分析工具和内置的Python环境pyflare进行了详尽的检查。在仔细检查了RMSD（均方根偏差）和主成分分析（PCA）的结果后，选择了对应于PDB 7M0K的结构用于FEP模拟。对图3-A到C的PCA图分析显示，7M0K的分子动力学模拟呈现出更窄的构象采样，并且更接近初始构象。

图3. A-C) 包括活性位点侧链所有重原子获得的主成分分析（PCA）图。可以使用颜色编码条追踪模拟的时间长度（纳秒，ns）。D) 在7M0K轨迹中对活性位点残基应用聚类分析得到的5个质心的叠加。

配体叠合

图4. 胺甲酰基的不同取向对静电互补性（EC）有较大影响。

从7M0K轨迹中选择了一个参考构象，对结合位点的蛋白质残基进行聚类分析，如图3D所示。在将同系物配体与参比配体（化合物#1）进行最大公共子结构（MCS）叠合后，使用静电互补性（EC）为部分配体选择优选的R基团的取向（图4），这有助于决定后续FEP运行的最佳起点。对于其他配体，则利用场点（Field Points）提供的信息，在最终优化过程中检查配体的结合模式（图5）。

图5. 在磺酰胺基团不同取向的叠合时，蛋白质的静电分子相互作用势表面（IPS）与小分子场点（FP）。

Flare FEP基准测试

图6. FEP计算数据集中28个配体的活性图

与先前的分子动力学（MD）使用相同的设置（包括GCNCMC）
平均无符号误差（MUE）小于1 kcal/mol
需要使用3个中间体
总体较低的链接迟滞（link hysteresis）
高精度的预测结果
22个配体的预测误差在约1 kcal/mol以内

图7. 包含所有转化的连接图

图8. FEP计算数据集中28个配体的3D视图，聚焦于发生取代的部分。

结论

仔细的受体准备对项目的成功至关重要，它提供了宝贵的信息，在定义工作流中的后续步骤时起到重要作用。

良好的叠合是实现准确自由能预测的基础，Flare分析工具在对这个流程的优化中是强大的助力。

HPK1的构象可塑性构成了重大挑战，但Flare FEP能够产生可靠的基准运行，为新设计的化合物进一步预测提供了坚实的基础。

文献

Vara, Brandon A., et al. Discovery of diaminopyrimidine carboxamide HPK1 inhibitors as preclinical immunotherapy tool compounds. ACS Medicinal Chemistry Letters. 2021, 12 (4), 653-661.
Wu, Ping, et al. Hematopoietic progenitor kinase-1 structure in a domain-swapped dimer. Structure. 2019, 27 (1) 125-133

用Flare FEP计算预测HPK1抑制剂的结合自由能

前言

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