摘要:本文叙述了拜尔公司科研人员用SPARK发现高效、选择性的SOS1抑制剂的研究过程:首先用片段筛选与高通量筛选发现了与SOS1结合的片段F1与化合物17;它们分别结合于SOS1的子结合口袋与主结合口袋;F1与17有部分重合,删除该重合后用Spark合理地设计了连接F1与17的连接臂;最后发现了化合物BAY-293,是一种KRAS-SOS1相互作用强效、选择性的抑制剂;并与KRAS的共价抑制剂具有协同作用。

编译:肖高铿
时间:2019-06-25

前言

GTPase的RAS家族由KRAS、NRAS与HRAS等组成,它们是主要的致癌基因,在人类癌症中的发生率高达20-30%1-3。RAS蛋白是个分子开关,在GTP结合的活性态与GDP结合的非活性态之间互相切换。在鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchangge factor,GEF)的激活下,处于GTP结合状态的RAS与许多效应物(effector)相互作用。 GTPase激活蛋白(GAPase-activating proteins, GAPs)通过加速内源性弱GTPase活性来下调活性RAS(高达5个数量级),从而驱动RAS恢复到失活状态。然而,致癌RAS突变体的GAP活性受损或大大降低,导致其被永久活化,这是致癌RAS信号传导的基础4;例如,通过RAS-RAF-MEK-ERK和RAS-pi3k-PDK1-AKT通路,两者都是细胞存活和增殖所必需的5

由于GTP对RAS结合位点具有极高的结合亲和力(皮摩尔水平)、并且结合位点缺乏其明确界定的口袋、以及RAS与GEF、GAP和效应物之间的蛋白-蛋白相互界面宽阔且平坦,这些都导致开发RAS的直接抑制极具挑战性。此外,试图开发非直接抑制剂也困难重重,比如靶向法尼基转移酶(Farnesyl transferase)间接抑制RAS的尝试尚未得到批准的药物6。鉴于这些直接或间接的方法目前都没获得成功的药物,RAS一度被认为是不可成药靶标。目前直接抑制RAS的策略主要聚焦于:

  • 用共价抑制剂靶向致癌突变体KRASG12C的Cys12
  • 靶向RAS-效应子相互作用(RAS-effector interaction)以干扰下调信号
  • 抑制RAS-GEF相互作用以阻止重新载入GTP7

前两个策略已经取得令人鼓舞的成功8-11,而靶向RAS-GEF相互作用目前尚未发现强效的抑制剂。此外,突变的RAS蛋白是否需要GEF活性来完全激活仍有待充分研究,并且可能因具体突变而异。研究最多的GEF是蛋白质SOS(Son of Sevenless),已知其有两种亚型SOS1和SOS2。人们已经对正构SOS螺旋设计模拟肽(peptide mimicking)来抑制RAS-SOS相互作用,发现了具有纳摩尔级别结合亲和力的碳氢订书肽(hydrocarbon-stapled peptide),遗憾的是,它的细胞活性很低12-13。采用基于片段的筛选、理性设计与高通量筛选也发现了靶向KRAS-SOS1相互作用、具有中等微摩尔亲和力的小分子14-17。令人吃惊的是,一些配体激活了SOS1介导的核苷酸交换而不是抑制,从而通过对SOS1的负反馈导致RAS信号的双相调节18

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拜尔公司的Roman C. Hillig等人19最近报道了高效、选择性抑制SOS1激活KRAS的小分子抑制剂BAY-293,该抑制剂能够通过干扰RAS-SOS1相互作用而阻断RAS活化。因致癌基因KRASG12C突变体在肺癌中的重要性而受到研究者的关注20,在该文中,研究人员首先通过片段筛选与高通量筛选分别发现了片段分子F1与SOS1抑制剂化合物17。高通量筛选命中的化合物17结合于SOS1的主结合口袋(PDB:5OVF),而分子片段F1结合于主结合口袋旁边的子结合口袋(PDB:6EPM)。F1与化合物17有部分叠合,然后作者将两者的叠合部分删除,用Spark的分子连接策略进行了虚拟筛选,合理地设计了可以连接F1与化合物17的连接臂,最后发现了化合物BAY-293,是一种KRAS-SOS1相互作用的强效、选择性的抑制剂。我们对该文的分子设计部分进行了综述,与大家分享该文关键的设计方法与结论。

基于片段的筛选

拜耳的科研人员决定采取双管齐下的方法:同时开展高通量筛选与和片段筛选。对一个含有3,000个片段的化合物库筛选出了与KRAS-SOS1蛋白-蛋白相互作用位点结合并可在该位点诱导构象变化的片段。其通过触发Phe890侧链的旋转,然后打开了与主结合口袋相邻的新子结合口袋。

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Figure 1. F1-SOS1复合物晶体结构(PDB: 6EPM)

片段F1被选作为进一步优化的起点。 F1与SOS1复合物晶体结构(pdb:6epm,图1)表明苯基部分与Phe890(Phe-out)发生 π-π 相互作用。氨甲基部分与Asp887和Tyr884的主链羰基形成氢键,并与Tyr884侧链形成额外的阳离子-π 相互作用。

高通量筛选与初步的优化

拜尔的科研人员还对一个含300万化合物的数据库进行了高通量筛选,结果发现了化合物1(IC50=320nM,Figure 2.)

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Figure 2. 化合物1(IC50=320nM)

用吡唑基苯基取代化合物1中的萘基部分得到化合物17(图3),显示出对SOS1的良好活性(IC50 = 140nM)和改善的水溶性。

化合物17与SOS1复合物晶体结构(pdb:5ovf,图3)解释了作用模式:化合物17的喹唑啉骨架夹在His905和Tyr884之间(π-π 堆叠)。吡唑基苯基部分占据了由Leu901和Phe890(Phe-in)组成的疏水口袋中,并与Tyr884的侧链有T-堆积相互作用。吡唑部分与Glu902形成水桥连的H-键。中心苯胺NH与Asn879的侧链形成H-键。

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Figure 3: 化合物17与SOS1SB的复合物晶体结构(PDB:5OVF)

SPARK的分子连接策略将片段F1与化合物17的连接起来

由于片段筛选识别了尚未被高通量命中化合物结合的新的子口袋,拜尔的科研人员尝试了使用Spark的配体连接方法:通过组合两种配体来进一步提高活性。如图4-A分析了化合物17(pdb:5ovf)和F1(pdb:6epm)晶体结构的叠加效果,表明这个策略是可行的。

将化合物17和F1叠合的芳基切除,作者用Spark进行了配体连接实验(图4-b,c)以确定合适的连接臂:使F1的四氢环戊[c]吡唑部分和17的氨基喹唑啉基团在SOS1的活性部位正确定位。在Spark给出的得分最高的连接臂中,噻吩连接臂被选中、合成、最后生物学测试发现是活性的。

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Figure 4. 片段F1与化合物17的配体连接: Figure 4A为F1-SOS1复合物结构(SOS1灰色, F1与Phe890洋红色)以及化合物17与SOS1复合物结构 (17与Phe890绿色); Figure 4B为片段连接策略示意图; Figure 4C为F1与17的场点图。

视频演示:起始结构的准备

本视频包含了:SOS1与F1、化合物17复合物结构的下载;蛋白结构准备;序列比对、蛋白叠合、化合物导出保存为起始结构starter.sdf。

视频演示:分子连接、发现先导化合物

在本视频中,包含了:(1)读入上一步准备好的起始结构;(2)准备连接点;(3)虚拟筛选。其中第一轮仅对对非常常见的片段库进行筛选,仅命中两个化合物。因此又进行了第二轮筛选,发现了文献报道的噻吩骨架:不同位置的取代基均被命中, 见Figure 5。

SPARK虚拟筛选命中的部分化合物如图5所示。其中左上角化合物为两个起始的分子;另外三个化合物为命中的化合物。

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Figure 5.SPARK虚拟筛选结果示例。

进一步优化发现BAY-293

对噻吩连接臂杂交出的苗头化合物引入模拟F1片段与氨基侧链氢键相互作用的极性部分(如OH,NH2)可以触发Phe-out构象,导致发现了活性优化的化合物23(BAY-293,IC50=21nM)。 如图6所示,化合物23的侧链氨基通过与Asp887和Tyr884主链羰基形成H-键相互作用以及与Tyr884侧链的阳离子-π相互作用与SOS1相互作用。

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Figure 6.化合物23与SOS1结合位点的相互作用模式(PDB: 5OVI)

进一步的筛选和抗增殖数据证明化合物23(BAY-293)是靶向KRAS-SOS1相互作用有效、选择性的抑制剂,并且表明抑制GEF可能代表着靶向RAS驱动的肿瘤治疗可行方法。

结论

拜耳的这篇论文展示了Spark方法的实用性。 除了作为一个极好的生物电子等排体基团替换之外,Spark的先进功能还包括易于使用的水分子替换方法、分子大环化、分子生长和分子连接等等。在拜尔的这个研究中,Spark建议了如何将占据蛋白结合位点不同部分的两个不同分子连接起来,并将SAR从一个系列转移到另一个系列,SPARK在其中起了至关重要的作用。

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