摘要：除了基于结构的设计之外，ligandscout还擅长于基于配体的设计：从一系列具有相似结合模式的化合物出发识别识别药效团模型。Ligandscout输入文件包含：训练集化合物与测试集化合物。训练集化合物用于生成药效团模型，测试集化合物继续多药效团模型打分，最后输出打分最高10个模型。本教程以CDK2激酶抑制剂为例，演示了导入化合物、化合物聚类、设置训练集与测试集、生成药效团的整个流程。
作者：肖高铿
一. Ligandscout与基于配体的设计
Ligandscout是专业的药效团建模与虚拟筛选工具，除了擅长基于结构的设计之外，还擅长于基于配体的设计：从一系列具有相似结合模式的化合物出发识别识别药效团模型。Ligandscout的输入文件包含：训练集化合物（活性化合物、非活性化合物）与测试集化合物（活性化合物、非活性化合物），训练集化合物用于生成药效团模型，测试集化合物继续多药效团模型打分，最后输出打分最高10个模型。Ligandscout还支持药效团聚类来准备训练集化合物，对输入化合物进行聚类分析，同一类的化合物用于建立药效团模型，同一靶点的不同的药效团模型最后通过Boolean运算合并筛选结果。
二、操作步骤
Ligandscout进行基于配体的药效团识别包含下述步骤：
- 导入配体
- 生成3D结构，对配体聚类
- 生成基于配体的药效团模型
三、详细描述
以CKD2激酶为例说明基于配体的药效团识别过程。
- 导入配体，设置训练集化合物
- 设置训练集化合物
- 根据3D药效团特征对训练集进行聚类
- 设置测试集化合物
- 建立基于配体的药效团模型
- 虚拟筛选与保存药效团模型
假设已知活性化合物以SMILES格式保存在cdk2.smi文件里。
点击Ligand-based切换到Ligand-based模式：File> Open> cdk2.smi
配体被导入，生成分子表单，其2D结构展示在屏幕的右侧, 如图1所示。
图1, 导入训练集化合物
默认条件下，刚导入的化合物处于被选中的状态，在表单中处于高亮、其2D结构也展示于右侧。如果化合物2D结构没有展示，请用按住鼠标左键，在表单的name列，从上往下拖动，则选中被拖过的化合物；或者按住Shift键，在表单name列先单击第一个分子，再单击最后一个分子，则全部的化合物被选中。
确保全部表单化合物被选中的情况下，将全部的化合物设置为训练集化合物，如图2所示。
Ligand-Set> Flag Selected Molecules > as Training Set
图2. Ligandscout提供Flag设置, 方便的给化合物添加各种标签，比如训练集
此时，分子表单标题栏的右边，三个按钮由灰色变为加亮状态（如图3所示），表示已经准备好进行构象生成、聚类与药效团生成了。
A
B
图3. 表单标题栏右边三个按钮的图标变亮，这三个按钮分别生成构象、聚类与药效团生成。
如图3所示，单击Ligand-set旁边的unnamed，可以给当前项目起个名字方便管理，比如CDK2。
点击聚类按钮（第二个按钮：cluster ligand-set），弹出ligand-set clustering setting对话框，全部参数用默认值，再点击OK按钮。
配体表单会出现一个新的列：Cluster ID。点击Cluster id，进行排序。
通过表单控制，将cluser id为1的化合物的type设为“test set”，结果如图示4。
图4. 聚类与设置化合物的type。
注意：聚类后发现，分为5类：其中1,2，3类只有一个化合物，4与5各有两个成员，不属于同一类的化合物不可以用于后面的药效团模型生成。在本文中，只是为了演示操作流程而将不同“类”的化合物一起作为训练集与测试集。实际研究不应该这么做！！！
注意：测试集与训练集的化合物应该尽量多样，最好各自有活性与非活性化合物（如果没有非活性化合物，可以将活性明显低100倍或1000倍的化合物视为非活性化合物）。
点击表单的第三个按钮(Create Ligand－based pharmacophore)按钮，开始生成药效团模型（大约需要2分钟完成）。
“Feature Pattern”展示了药效团元素组成，点击一个色块，会链接向对应的药效团元素。在右下角展示了生成的一组药效团模型：点击不同模型，对应的3D模型与配体就会屏幕上展示出来（见图5）。
图5. 计算结果的界面
点击3D视窗右上角的data exchange小部件将当前药效团复制到其它地方，比如screen prospective进行虚拟筛选；还可以通过”File>Save”菜单将当前所见的药效团另存为一个新文件。
图6. 基于配体的药效团识别流程总结
四. 从这里开始，我能做些什么？
- 将基于结构的模型与基于配体的模型进行叠合
- 在LigandScout里对数据库进行虚拟筛选
五. 基于配体的药效团识别算法与实践技巧
5.1 基于配体的药效团识别算法
Ligandscout药效团识别算法总结如下：
- 用训练集活性化合物生成全部可能的公共药效团模型。
- 用训练集非活性化合物对第一步生成的模型进行打分：被非活性化合物命中的模型打分变差。
- 用测试集活性化合物/非活性进一步对模型进行打分：与活性化合物匹配的模型被加分、不匹配则减分；与非活性化合物匹配则减分、不匹配则加分。
- 模型根据打分值进行排序，保留打分最高的10个模型
鉴于药效团识别过程本质是个SAR的建模过程，因此，对于训练集与测试集化合物的准备也有要求：1）训练集活性化合物结构要多样，不要冗余；2）活性化合物与非活性化合物尽量相似。
5.2 技巧
- 训练集(training set)、测试集(test set)与忽略的(Ignored)化合物设置
- 活性化合物与非活性化合物的设置
- 我怎么知道3D视窗中那些球对应什么样的药效团元素(Feature)?
- 为什么有的药效团元素发虚?
- 为什么有的药效团元素为双色相间?
Ligandscout分子表单支持化合物类型设置：Training-set，Test-set，Ignored。其中Training-set意味着化合物在生成药效团模型作为训练集使用；Test-set意味作为测试集使用；Ignored意味着忽略这个化合物，在建模过程中不考虑这个化合物。有两种方式可以设置化合物的类型：
(1)通过Ligandscout分子表单的Type列的下拉菜单来选择:
(2)通过Flag来设置
选择化合物：在分子表单中，按住Shift键，用鼠标单击Name列要设置的化合物。
再从菜单Ligand-Set>Flag Selected Molecules来设置。
Ligandscout分子表单有Active列，点击Active列下各个化合物对应的方框可以设置活性类型：实心为活性化合物，空心为非活性化合物。是否为活性还是非活性：取决于自己的实验数据。
同训练集与测试集的设置一样，Ligandscout通过Flag可以很方便的批量设置。
用鼠标单击感兴趣的药效团元素，Liganscout的视窗会给出标签，同时左则的Pharmacophore列表对映的药效团元素也被高亮。
这是因为有的药效团元素不是必须而是可有可无的：匹配该元素可能增强活性，不匹配不丧失活性。这类药效团元素在3D视窗上就“发虚”。
Ligandscout用训练集与测试集建立药效团模型，会根据匹配情况自动设置药效团元素是否为option,你还可以手动设置一个药效团元素是否为option：用鼠标单击药效团元素以便选中，然后在菜单中Pharmacophore>Mark Feature as Optional.
Ligandscout支持同一个位点有两个药效团元素：比如既是氢键受体、也是供体。如果出现这样的情况，这两个元素在3D图形上显示为双色相间。
六. 应用案例
Ligandscout应用案例–基于配体的药效团建模与虚拟筛选发现全新17β–羟基类固醇脱氢酶2抑制剂
http://www.molcalx.com.cn/ligandscout_jmc2014
Anna Vuorinen et al. Ligand-Based Pharmacophore Modeling and Virtual Screening for the Discovery of Novel 17β -Hydroxysteroid Dehydrogenase 2 Inhibitors. J. Med. Chem. 2014, 57, 5995 −6007
17β-羟基类固醇脱氢酶2（17β-HSD2）催化雌二醇到雌素酮的失活转化，对它的抑制可作为治疗骨质疏松症，改善雌激素缺乏症的治疗选择。作者使用LigandScout构建了17β-HSD2抑制剂的药效团模型，进行虚拟筛选，生物实验证明29个苗头化合物中有7个具有低微摩尔级IC50活性。为了进一步研究其构效关系（SAR），从SPECS数据库中又挑选了30多个衍生物用于测试。最终发现3个活性最好的化合物，最低活性达240 nM。还发现了1个对17β-HSD1具有选择性的抑制剂，3个对其他相关HSD具有选择性，6个对其他HSD没有影响。
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