摘要：在本文中，我们用QPCT/SEN177的共晶结构PDB 6GBX作为QPCTL/SEN177结合模型的代理，用GIST方法分析了apo结合位点，发现了两个重要的结合水。然后根据Unhappy water规划了SEN177的吡啶母核生物等排体替换策略，并用Spark重现了文献验证过的新设计QP5020。这证明了我们的方法能够替换Unhappy桥连水分子并正确的识别出苯甲腈片段做为吡啶母核的替换结构。此外，还根据Happy water识别SEN177正确的结合模式，这个结合模式可以解释文献报道系列化合物的SAR，同时还可以用MM/GBSA对已知化合物进行排序、分类，并用来指导侧链吡啶的生物等排体替换。最后，还对SEN177的Zn离子结合片段进行基团替换，重现了文献报道QP5038的设计，还命中尚未有文献报道的新化学骨架类型，有望发展出新的系列化合物。

QPCTL抑制剂SEN177的骨架跃迁及结合模式探讨-墨灵格的博客

肖高铿/广州市墨灵格信息科技有限公司
徐锡明/中国海洋大学
2024-02-01：第一次发布
2024-02-19：补充了Zn离子结合片段三氮唑的生物等排体替换

前言

谷氨酰胺酰肽环转移酶样蛋白（Glutaminyl-peptide cyclotransferase like protein，QPCTL或isoQC）是谷氨酰胺肽环化转移酶（QPCT）的同工酶，催化靶蛋白（如CCL2、CCL7和CX3CL1）上的N-末端谷氨酰胺和谷氨酸残基的环化，形成焦谷氨酸残基。Logtenberg等人1与Wu等人2的研究表明，QPCTL介导了CD47焦谷氨酸的形成，对CD47/SIRPα结合起到至关重要的作用，是调控CD47/SIRPα相互作用的关键因子，并起到“不要吃我（Don't eat me）”信号的作用。还发现QPCTL缺失显著增强巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用1,2。此外，抑制QPCTL可以通过重塑髓系细胞的浸润来增强PD-1阻断的功效3。这些研究表明，QPCTL是一个有吸引力癌症治疗靶标3。

近几十年来，人们以将靶向QPCT的小分子抑制剂开发用于阿尔茨海默氏病的治疗，其中一些抑制剂，包括SEN177（图1），也表现出对QPCTL的抑制活性。针对肿瘤免疫治疗的QPCTL抑制剂的研究尚处于早期阶段，因此新型高效的QPCTL抑制剂有待开发。

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图1. 以SEN177（青蓝色化合物）与QPCT共晶结合模型（PDB 6GBX）为起点设计的QPCTL抑制剂QP5020（化合物4）与QP5038（化合物38）。图片来源于Yu等人的文章4。

最近，Yu等人4报道了利用基于结构的方法以SEN177为起点设计了一系列QPCTL抑制剂。虽然尚未有SEN177与QPCTL的共晶结构，但是QPCT与QPCTL活性位点之间存在高度保守的结构，因此假设SEN177与QPCTL的结合方式与QPCT相似。根据SEN177和QPCT结合模型（PDB 6GBX），一个值得注意的特征是吡啶母核的氮原子与Gln304的骨架NH经由结构水分子介导形成氢键相互作用，如图1所示。为了提高结合亲和力，将SEN177吡啶母核中的氮原子替换为腈基，以产生含苯甲腈的化合物4（QP5020，见图1），因为模拟或置换结合位点水分子是一种行之有效的策略。作者评估了QP5020对QPCTL的抑制活性，结果表明QP5020的活性是SEN177的8.7倍，对QPCTL的IC50 = 15.0±5.5 nM。在进一步对Zn离子结合片段三氮唑优化之后，得到了化合物28（QP5038，见图1），对QPCTL的IC50 = 3.8 ± 0.7 nM。

在2021年8月份的时候，有幸与中国海洋大学的徐锡明博士一起探讨QPCTL/QPCT抑制剂的设计，其中一个系列化合物的设计策略也是用腈基替换PDB 6GBX介导配体与蛋白氢键网络的结合水HOH558，并设计了与QP5020同样的化合物，参见与徐博士的微信聊天截图5。可惜缘分不够，在后续对不同系列进行的优先性排序中，QP5020并没有进入下一轮的合成与活性测试，最终失之交臂。本文将重现这个设计过程并分享对SEN177结合模式的理解。

在本文中，以化合物SEN177以及桥连的水分子HOH558为起始分子用SPARK6进行片段替换，目的是验证我们的方法能否替换桥连水分子并正确的识别出苯甲腈片段做为吡啶母核的替换结构。本文的另一个目的是，用Flare7的GIST分析结合位点的水能量特征，并结合分子对接与量子化学计算认为PDB 6GBX共晶结构中A链的SEN177结合模式可能是错误的，认为B、C链的SEN177结合模式才是正确的，并用Yu等人4公开的系列化合物（表1）来验证我们的假设。

表1. Yu等人4公开的部分QCPTL抑制剂及其体外活性。

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最后，还用QM计算方法发现Zn离子结合片段的优化机会，并用QM计算结果指导Spark对Zn结合片段进行骨架跃迁，重现Yu等人4对化合物28的设计。

结果与讨论

发现关键的结合水：HOH558与HOH581

分析PDB 6GBX的结合口袋，我们会注意到两个靠近配体的水：HOH558与HOH581，如图3所示。其中HOH558作为水桥介导了配体与蛋白的氢键网络：一方面作为氢键供体与配体SEN177吡啶母核上的N原子发生氢键相互作用，另一方面作为氢键受体与蛋白GLN304骨架酰胺NH发生氢键相互作用，同时还与HOH725（未显示）发生氢键相互作用。

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图3. 在PDB 6GBX中, 涉及两个关键的结合水：HOH558与HOH581。其中黄色配体为SEN177。

如图3所示，HOH581作为水桥介导了几个蛋白残基间的相互作用：一方面作为氢键供体与GLU202侧链羧基发生氢键作用，一方面作为氢键受体与ALA303主链酰胺NH发生氢键相互作用，同时作为受体与LYS144末端的氨基阳离子发生氢键相互作用。HOH581的氧原子与配体2-氟吡啶侧链C之间的距离为3.1埃，这个距离足以带来立体排斥，有必要了解HOH581在这种排斥作用下为什么没有离开。

与配体接触的水桥分子可以为基于结构的设计提供很多思路，分析它们的能量学特征有助于确定下一步的设计方案，因此采用GIST对apo结合口袋进行分析。

对apo结合口袋进行GIST水分析：HOH558是Unhappy water，HOH581是Happy water

对PDB 6GBX的apo结合口袋进行GIST水分析，可以发现大部分的共结晶水以及配体上与蛋白发生相互作用的氮原子都被高密度（density=4）的水等值图覆盖。如图4所示，可以看到HOH558与HOH581上有density=4的等值图覆盖。

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图4. 对PDB 6GBX的apo结合口袋进行GIST分析的水密度等值图(Density=4)。

图5展示了local ΔG = 0.5 kcal/mol（红色）与local ΔG = -0.5 kcal/mol（绿色）等值图，这是ΔG与Density=4等值图的交集，意味着被这些等值图覆盖的区域不仅在自由能上显著地不同，而且也是高密度水覆盖的区域。从图5可以看到，在apo状态的6GBX配体结合口袋里，HOH558被一个红色的等值图覆盖，意味着local ΔG大于0.5，是个Unhappy water；而HOH581被一个绿色的等值图覆盖，意味着local ΔG小于-0.5，是个Happy water。

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图5. PDB 6GBX结合口袋GIST分析local ΔG等值图(Density=4)。红色:ΔG=0.5kcal/mol, 绿色ΔG=-0.5kcal/mol。

对于HOH558这个桥连蛋白与配体氢键的Unhappy water可以采用替换策略，让配体模拟这个水与蛋白直接相互作用；对于HOH581这个桥连蛋白氢键网络并且靠近配体的Happy water可以采用与其发生相互作用的设计策略，也就是将其视为蛋白的一部分，设计配体与这个水发生有利的相互作用。

SEN177的re-docking实验：SEN177的结合模式是错误的，选择正确的SEN177结合模式

Pozzi等人11解释了SEN177-QPCT共晶结构（PDB 6GBX），文章所述的SEN177结合模式应该是错误的。在准备蛋白结构的时候发现，PDB 6GBX包含A、B、C三个链，其中A链的SEN177结合模式就是Pozzi等人11描述的，不同于B、C链，主要区别在于侧链吡啶的取向不同。这就需要确认哪个结合模式更合理，暂且假设A链的结合模式是对的并将A链作为默认的研究对象进行redocking研究，下面将证明Pozzi等人10所述的SEN177的A链结合模式是错误的，并在这个过程中得到正确的那个。

用Flare Dock在‘Very Accurate but Slow’模式下将SEN177对接到6GBX的结合位点，对接时将Zn作为蛋白的一部分。为了考察“Happy water”-HOH581与“Unhappy Water”-HOH558对SEN177结合模式的影响，在分子对接的时候也将这两个水分子作为蛋白的一部分。对接结果表明，与共晶结构的侧链吡啶相比，打分最佳pose的侧链吡啶发生了180°翻转，其余部分几乎完全一致，如图6所示。

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图6. SEN177的Re-docking实验。左：PDB 6GBX共晶结构结合模式；右：对接预测的结合模式。

图7以叠合的方式呈现了X-Ray共晶结合模式(黄色配体)与docking预测的结合模式（浅棕色），可以更直观地发现两者的差异：吡啶环侧链发生了180°翻转。

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图7. SEN177的Re-docking实验结合模式比较。黄色：PDB 6GBX共晶结构结合模式；浅棕色：对接预测的结合模式。

从蛋白配体相互作用的角度上讲，显然对接预测的结合模式比PDB 6GBX的结合模式更加合理：因为对接预测的结合模式其吡啶环氮与“Happy water”HOH581发生有利的强氢键相互作用，而PDB 6GBX共晶结合模式却存在不利的立体排斥。这意味着PDB 6GBX的结合模式是错误的！这可以进一步从Yu等人4系列化合物的SAR得到支持：如表1所示，当R1的吡啶基可作为与HOH581发生氢键相互作用的受体时，则化合物具有良好的活性，比如化合物SEN177,4,5,9与28；当R1为的吡啶基或苯环缺乏与HOH581发生氢键相互作用的受体时，则化合物活性丧失，比如化合物6与7。

此外，用Flare MM/GBSA方法对表1化合物的打分结果表明，MM/GBSA-dG值与实验pIC50具有强线性相关性，Pearson R2=0.46，如图8所示。图8中圆圈大小表示pIC50的大小，可以发现非活性化合物6、7位于横坐标的dG正值区，活性化合物位于横坐标dG的负值区，活性与非活性化合物得到完美区分。

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图8. 当侧链吡啶基与HOH581发生氢键相互作用的结合模式时，MM/GBSA结合自由能预测值(MM/GBSA-dG)与实验pIC50具有强的相关性。

如果将化合物SEN177,4,5,9,28的侧链吡啶还原为PDB 6GBX的结合模式时，如图9所示，此时MM/GBSA预测的结合自由能与实验pIC50不仅没有表现出任何的相关性，Pearson R2=0.003，而且也不能区分活性与非活性化合物。

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图9. 当侧链吡啶基采取PDB 6GBX的结合模式时，MM/GBSA结合自由能预测值(MM/GBSA-dG)与实验pIC50没有表现出相关性。

需要注意的是，在Yu等人4的文章中并没有化合物6、7的IC50确切值。在进行结合自由能预测值与pIC50实验值相关性分析时，为了让分析可以进行，人为地将化合物6、7的IC50设置为1000nM。因此，上述的相关性分析并不是严格的定量分析，但是不妨碍定性的趋势与分类分析。

当然，上述的分析都是建立在HOH581与周围残基GLU202,ALA203,LYS144形成氢键网络的基础上，因为这个氢键网络会迫使HOH581的一个氢原子会大致指向SEN177的侧链吡啶，如图3所示。如果不考虑HOH581与蛋白的三个残基氢键网络，仅考虑HOH581与SEN177的侧链吡啶，则无论氮原子的取向如何HOH581与侧链吡啶均会发生“氢键”相互作用。这一点可以通过来量子化学计算来说明。为了方便计算，从准备好配体与蛋白结构（见材料与方法部分）中分别截取2-氟吡啶与HOH581作为相互作用研究用的模型分子（图10），对两个氮取向的体系用PSI4在bp86-d3/def2-tzvpp理论水平下固定C,N,O原子坐标进行真空状态下的结构优化，结果如图10所示。

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图10. 模型分子在BP86-D3/DEF2-TZVPP理论水平下QM结构优化的结果

我们可以看到，当2-氟吡啶为PDB 6GBX的取向时（图10-左），吡啶C与HOH581的氧原子间距离为3.1埃，HOH581的两个氢远离吡啶，吡啶的C-H指向HOH581的氧原子，这形成了C-H--O氢键。这个C-H--O氢键可以从isoValue=0.020 e/au3电子密度表面（图11-左）看出：在C-H与O之间形成了一个明显的电子密度桥。当2-氟吡啶为PDB 6GBX的翻转构象时（图10-右），吡啶C与HOH581的氧原子间距离为3.1埃，HOH581中的一个氢原子指向吡啶氮原子，这形成了经典的氢键相互作用。从翻转构象的isoValue=0.020 e/au3电子密度表面（图11-右）也可以清晰地看到吡啶氮原子与HOH581氧原子之间的电子密度桥。

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图11. 模型分子的电子密度表面（isoValue=0.020 e/au3）。左：PDB 6GBX的构象；右：翻转后的构象

显然，当HOH581与PDB 6GBX取向与2-氟吡啶发生C-H--O氢键相互作用时（图10-左），HOH581的氢取向不利于与周围的蛋白残基形成氢键网络；而HOH581与翻转构象的2-氟吡啶发生经典氢键相互作用时（图10-右），HOH581的氢取向还可以与周围的蛋白残基形成氢键网络。用对称匹配微扰理论(SAPT)方法在sapt2+(3)dmp2/def2-tzvpp理论水平下计算上述优化过的2-氟吡啶与HOH581复合物的相互作用能（见材料与方法部分），结果表明HOH581与2-氟吡啶之间的C-H--O、N--H-OH氢键取向的相互作用能分别为-1.385与-5.170kcal/mol。这说明经典氢键比C-H--O氢键的相互作用强的多，也就是翻转之后的2-氟吡啶片段与HOH581之间具有更加有利的相互作用。

综合结合位点GIST水分析结果、分子对接结果、QM计算以及现有化合物的SAR，可以推定：PDB 6GBX A链中QPCT-SEN177的共晶结合模式应该是错误的，正确的结合模式应该将侧链吡啶翻转使得吡啶氮原子与HOH581发生氢键相互作用，也就是B、C链的SEN177结合模式才是对的。正确的结合模式可以被MM/GBSA的结合自由能预测值用来对现有的化合物进行分类：活性与非活性化合物得到完美区分，而根据PDB 6GBX A链结合模式进行的MM/GBSA结合自由能预测值不能区分活性与非活性化合物。选择正确的结合模式对于之后的吡啶环侧链的替换设计至关重，也是区别于Yu等人4对结合模式认识不同的地方。

如材料与方法部分的蛋白结构准备小节所述，PDB 6GBX包含A、B、C三个链，之前的分析是根据A链进行的，SEN177的正确结合模式实际出现在B与C链里面。徐博士猜测很可能A链的配体结合模式可能是原作者不小心弄错的。无论如何，B、C链里面的配体构象佐证了我们之前的分析是正确的，使用PDB 6GBX进行基于结构的设计时应该选用B、C链。

SPARK水分子替换：重现QP5020的设计

在PDB 6GBX里，如前所述，HOH558是一个ΔG大于1.5kcal/mol的Unhappy water（apo结合口袋），因此具备可替换的热力学基础；同时也可以起到“水桥”的作用，介导了配体与受体的氢键网络。替换此类Unhappy water并与蛋白形成氢键相互作用可以增强配体的结合亲和力。替换实验用Spark来实现，图12展示了水分子替换实验的规划：高亮部分显示了需要被替换的分子片段与水。

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图12. 用Spark替换吡啶母核与Unhappy water-HOH558的实验规划。

将共晶配体与HOH558作为替换实验的起始分子，如图13所示，高亮部分为要被替换的部分，链接点1、2的原子设置为芳香环原子以便使得结果接近起始分子。

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图13. 替换实验的起始分子

为了更好的模拟水分子，如图14所示，设置了两个约束条件：1）在HOH558氧原子处添加氢键受体的药效团约束；2）在HOH558氧原子的负静电场点处添加场约束。

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图14. 替换实验的约束设置

在这个替换实验里，对ChEMBL_common,VeryCommon与Common三个数据库共161854个分子片段进行了虚拟筛选，如图15所示。

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图15. 替换实验的数据库设置

打分函数采用了基于配体相似性的方法，其中形状与场相似性比例为50：50，如图16所示，最后保留打分值最高的500个结果。

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图16. 替换实验的打分函数

计算完毕，命中500个结构，共73种不同的化学类型骨架。打分最高的骨架类别为苯环，总共命中苯环衍生物361个。其中包含了Yu等人4报道化合物4（QP5020），其在500个结果里排名第2。QP5020与起始分子的Shape score = 0.917,Field score= 0.862。场点比较如图17所示，可以看到苯甲腈的CN方向上有一个蓝色的场点与起始分子水的蓝色场点一致。

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图17. 起始分子（左）与替换实验排名第2结果（QP5020，右）的场点比较

用Flare Dock在‘Very Accurate but Slow’模式下将替换实验排名第2（QP5020）的结果对接到6GBX的结合位点，对接时将Zn与“Happy water”-HOH581作为蛋白的一部分。对接打分最佳的结合模式重现了Spark生成的Pose，如图18所示，苯甲腈片段替换吡啶母核之后，腈基替换了HOH558并与GLU304的主链酰胺NH发生氢键相互作用，其中侧链吡啶氮与“Happy water”-HOH581发生氢键相互作用。这个相互作用是与Yu等人4描述的结合模式最大区别所在。

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图18. 替换实验排名第2结果（QP5020）的redocking结合模式

总的来说，Spark的水分子替换实验以高分（排名第2）的方式将苯甲腈片段识别为吡啶母核的替换结构，命中了Yu等人4报道的化合物4（QP5020）。该化合物与起始化合物（包括水在内）具有高度相似的形状与静电场，对接实验可以重现预期的相互作用模式。在与徐锡明博士交流的时候，一致认为这是个相当完美的设计，并入选到下一轮的优先性排序里5。

XED场点分析发现Zn结合片段的优化机会

可视化分析化合物4的XED场点，如图19-左所示，可以发现N-甲基三氮唑的蓝色负场点偏离Zn离子，这提示了化合物4的三氮唑与Zn的结合模式存在不利的几何而可能对活性不利，因此这里有潜在的优化机会，有必要用QM进一步确认。相比之下，化合物28（QP5038）的N-甲基咪唑的蓝色负场点与Zn离子重合，如图19-右所示，N-甲基咪唑与Zn具有更有利的静电相互作用。

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图19. Zn结合片段的XED场点。左：N-甲基三氮唑（代理QP5020，化合物4）; 右：N-甲基咪唑（代理QP5038，化合物28）; 粉红色球：Zn2+离子

用QM方法在APFD/6-311+G(d,p)理论水平对Zn结合片段进行了几何优化（详见材料与方法部分），结果如图20所示：N-甲基三氮唑-Zn的几何发生显著的变化，角Zn-N3-N4由结合模式的～116°变为69°；相比之下N-甲基咪唑-Zn的几何没有发生显著的变化，角Zn-N3-C4由由结合模式的116°变为125°。这说明，与Zn离子结合时，QP5020（N-甲基三氮唑片段）要比QP5038（N-甲基咪唑片段）消耗更多的结合能去维护结合模式，导致N-甲基三氮唑比N-甲基咪唑片段不利于与QPCTL结合。

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图20. Zn结合片段的QM几何优化。上：N-甲基咪唑（代理QP5038）；下：N-甲基三氮唑（代理QP5020）。左：结合模式的几何；右：QM优化的几何

QM几何优化的结果与XED场点分析是相一致的：N-甲基三氮唑-Zn的QM几何优化结果表明，Zn出现在了XED蓝色负场点处。这从计算上证实了Zn离子与三氮唑并没有达到最好的相互作用几何。而N-甲基咪唑-Zn在基于QM的几何优化之后Zn离子位置几乎没有变化，这意味着Zn离子与N-甲基咪唑有着较好的相互作用几何。因为XED场点的计算比起QM来说要快的多，所以它的另一个重要用途是快速发现静电不匹配的片段，以发现优化的机会，比如这里的发现N-甲基三氮唑Zn离子结合片段的优化机会。

用QM评估N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑以及咪唑等结合片段与Zn离子的相互作用能

在Yu等人4的研究中，化合物28(QP5038）与29的唯一区别在于Zn离子结合片段：前者为N-甲基咪唑，后者为咪唑，见表2。28、29化合物的一个甲基差异引起了260多倍的IC50差异，这是一个标准的活性悬崖现象，可归因于两个片段与Zn的相互作用能差异。接下来我们用QM方法来计算不同结合片段与Zn离子的相互作用能，并用计算结果来解释28与29的活性悬崖。

表2. 化合物28与29的QPCTL体外活性4

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基于QM的相互作用分析可以定量计算分子间的相互作用能。在BP86-D3/DEF2-TZVP理论水平下对N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑、咪唑进行几何优化，然后用Flare叠合到PDB 6GBX的SEN177的N-甲基三氮唑获得它们的结合模式。然后使用PSI49,10实现的对称匹配微扰理论(SAPT)方法在sapt2+(3)dmp2/def2-tzvpp水平下计算模型分子N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑、咪唑与Zn之间的相互作用能(见材料与方法部分)，结果如表3所示。

表3. N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑、咪唑与Zn2+离子的SAPT相互作用能分析结果

Items N-甲基三氮唑 N-甲基咪唑 咪唑
Electrostatics -113.850 -121.096 -114.4423
Exchange 48.250 52.648 56.863
Induction -92.950 -101.069 -95.706
Dispersion -5.088 -5.340 -5.653
Total SAPT2+(3)dMP2 -163.638 -174.857 -158.940


结合片段-Zn相互作用能对抑制剂的活性影响可以被实验证实，N-甲基咪唑比脱去甲基之后的咪唑与Zn的结合能增加了19.5 kcal/mol，由-174.857 kcal/mol变化为-158.940 kcal/mol（见表3），相应地化合物活性也降低，对QPCTL的体外抑制活性IC50由28的3.8 nM变化为在1000 nM水平测不到29的抑制活性，见表2。

QM方法可以用来对不同的Zn结合片段进行优先级排序。比之N-甲基三氮唑与咪唑，N-甲基咪唑与Zn具有更有利的静电相互作用（Electrostatics）与诱导相互作用（Indution），这两项有利的相互作用远大于不利的排斥项（Exchange），最终导致N-甲基咪唑比N-甲基三氮唑、咪唑具有更强的Zn离子相互作用能。结合片段-Zn相互作用能与抑制剂的活性有直接的关系，相互作用能越强，抑制活性越强。

Zn结合片段N-甲基三氮唑的生物等排体替换：重现QP5038的设计

上一节的QM计算与XED场分析表明，PDB 6GBX的N-甲基三氮唑与Zn的结合模式并非低能几何构象，因此与Zn结合更好的片段有望提高结合亲和力，其要点是新片段的负场点与Zn重合，这可以用来指导后续的Spark生物等排体替换实验。

N-甲基三氮唑的替换用Spark V10.7的等排体替换工作流6来实现，起始分子同前面QP5020的设计小节，并且将蛋白结构作为体积约束使用，如图21所示，连接点1的原子类型设置为：Csp3、Csp2、Car、Nsp3、Nsp2 and ring atom only。

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图21. Zn离子结合片段的生物等排体替换起始分子及参数设置

为了让新化合物能与Zn离子具有更好的相互作用模式，在约束编辑器里使用“Move”工具将N-甲基三氮唑的蓝色负场点移动至Zn离子上，如图22所示。

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图22. Zn离子结合片段的生物等排体替换的约束设置

然后对ChEMBL_common,VeryCommon与Common三个数据库共161854个分子片段进行了虚拟筛选，如图15所示，其它参数同QP5020的设计小节。结果命中了500个结构，共包含152种不同化学骨架类型。按骨架打分从高到低排序，打分最高的化学骨架是三氮唑本身、排序第2的为四氮唑、排序第3的为咪唑，如图23所示。

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图23. Zn离子结合片段的生物等排体替换实验结果。左上：起始分子SEN177；左下：Rank#1；右上：Rank#3；右下：Rank#2

在打分最高的化学类型中，只有排名第2的咪唑类片段的蓝色负静电场点满足预设的要求，以此为过滤条件，N-甲基咪唑是替换实验首选的结果，这正是Yu等人4报道QP5038的Zn结合片段。

总的来说，根据N-甲基三氮唑-Zn的QM几何优化与结合模式的XED场分析结果来指导Spark生物等排体替换实验可以在打分最靠前位置命中N-甲基咪唑作为新的Zn结合片段，并被Yu等人4报道的QP5038所验证。Spark还命中其它尚未被文献验证的高分Zn结合片段，这些片段有望发展出新的系列化合物。

材料与方法

蛋白结构的准备

鉴于QPCTL与QPCT的结合口袋具有保守性，因此直接以QPCT-SEN177的共晶结构PDB 6GBX作为QPCTL-SEN177结合模型的代理进行分析。将共晶结构PDB 6GBX下载到Flare7中，并用Protein Prep工具进行结构准备以添加氢原子、优化氢键、消除原子冲突并给蛋白结构与配体分配最佳质子化状态，任何截短的蛋白质链被封端作为蛋白质准备的一部分。

注意到PDB 6GBX包含A、B、C三个链，A链配体的构象与B、C链的不同，如图24所示：A链配体的侧链2-氟吡啶氮不与HOH581形成氢键相互作用；B、C链配体的侧链2-氟吡啶发生翻转，使得吡啶氮与水发生氢键相互作用。

QPCTL抑制剂SEN177的骨架跃迁及结合模式探讨-墨灵格的博客

图24. PDB 6GBX进行结构准备之后，A链配体与B、C链配体的结合构象是不同的。左：A链；中：B链；右：C链

由于配体具有两种可能的结合模式，因此有必要论证哪个结合模式是正确的。在本研究中，我们暂且先假设链A的配体构象是正确的，在后续的研究中将会证明这个假设是错误的，而B、C链中地配体结合模式才是对的。根据这个假设，将B与C链删除，仅保留A链，并将A链的配体SEN177从蛋白中提取出来到配体表单，删除Other里面的硫酸根离子与乙二醇(EDO)而仅保留Zn离子。

配体结构的准备

以上一步蛋白结构准备提取出的配体SEN177为模板，用Flare7在结合口袋里编辑SEN177，准备出表1的其它化合物结构，并在蛋白背景下用力场进行能量最小化。

3D-RISM分析

用Flare 3D-RISM模块针对准备好蛋白A链apo结合口袋（包含Zn离子）进行分析，使用了如下条件：

  • XED force field and charge method
  • 0.4Å grid spacing
  • 14Å grid external border width
  • Convergence tolerance: 10-8
  • Maximum number of iterations: 10,000
  • Total formal charge handling: neutralize with counterions.
  • Protein: 6GBX_P
  • Chain: A Chain, A Other
  • Ligand: None

计算完毕，蛋白的A链会多出一条名称为A 3DR的水链，注意3DR链中仅含氧原子。

GIST分析

以3D-RISM结果作为用Flare GIST的输入，对apo结构（包含金属离子与水）的配体结合位点进行GIST分析，使用了如下条件：

  • Calculation method: Normal
  • Ligand: None
  • Grid spacing:0.5 Å
  • Grid Definition：Ligand
  • Protein: 6GBX_3DR_P
  • Chains: A Chain, A 3DR, A Other
  • Simulation length: 20ns
  • Solvent Model: explicit TIP4Pew Water

用Spark进行水分子替换

用Spark V10.76来进行基团替换实验，这是一个以被充分验证的方法8。在本文中，我们采用Spark的等排体替换工作流来进行水分子替换，其中起始分子与要替换的水分子是在从前面的蛋白结构准备与配体结构步骤得到。

起始分子：starter.sdf

MM/GBSA预测结合自由能

用Flare MM/GBSA7来对表1化合物进行单点结合自由能预测。在预测SEN177时将HOH581,HOH558与Zn作为蛋白的一部分；而在预测4,5,6,7,9与28时将HOH581与Zn作为蛋白的一部分。其它参数如下：

  • Calculation method: Normal
  • Solvent Model: Implicit | Implicit GBn2
  • Minimize: Protein and Ligand

在Yu等人4的文章中并没有化合物6、7的IC50确切值，在进行IC50的预测值与实验值相关性分析时，为了让分析可以进行，人为地将化合物6、7的IC50设置为1000nM。

2-氟吡啶与HOH581复合物的电子密度表面计算

用Flare QM在B3LYP-D3BJ/6-311G(d,p)理论水平对2-氟吡啶与HOH581的复合物进行单点计算，然后在Flare Surfaces工具里调整QM electron density的isoValue值为0.020获得图11的电子密度表面。

对称匹配微扰理论(SAPT)计算相互作用能

使用PSI49,10实现的对称匹配微扰理论(SAPT)方法在sapt2+(3)dmp2/def2-tzvpp水平下计算模型分子2-氟吡啶与HOH581之间的相互作用能。

2-氟吡啶（PDB 6GBX构象，图10-左）与HOH581的相互作用能计算：

memory    24 GB
 
molecule dimer {
0  1
 C                 -2.00370000   -1.16990000   -0.02770000
 C                 -0.61860000   -1.46650000    0.11490000
 C                  0.35050000   -0.49820000    0.18040000
 C                 -0.02670000    0.79110000    0.07490000
 F                  0.85570000    1.79640000    0.11420000
 N                 -1.34490000    1.15130000   -0.08210000
 C                 -2.35900000    0.16330000   -0.15240000
 H                 -0.31910000   -2.50640000    0.18990000
 H                 -3.36380000    0.54010000   -0.28730000
 H                  1.39380000   -0.76300000    0.28840000
 H                 -2.73750000   -1.96520000   -0.07190000
--
0 1
 O                  3.37820000   -0.71960000   -0.15730000
 H                  4.16130000   -0.66360000    0.38690000
 H                  3.49830000   -0.03060000   -0.84180000
}
 
set {
    scf_type DF
    freeze_core True
    basis def2-tzvpp
}
 
energy('sapt2+(3)dmp2')

用24核心执行计算：

psi4 dimer.com dimer.log -n 24

结果：

  Total SAPT2+(3)dMP2              -2.20648055 [mEh]      -1.38458745 [kcal/mol]      -5.79311388 [kJ/mol]

2-氟吡啶（翻转构象，图10-右）与HOH581的相互作用能计算：

memory 24 GB
 
molecule dimer{
0 1
 C                  1.98260000   -1.15820000    0.01660000
 C                  0.59980000   -1.46960000   -0.11710000
 C                 -0.01680000    0.78110000   -0.06230000
 F                 -0.99700000    1.68630000   -0.11530000
 C                  2.32400000    0.17830000    0.14480000
 H                  0.25210000   -2.49210000   -0.20130000
 H                  3.35210000    0.49540000    0.26780000
 H                  2.71760000   -1.95190000    0.04460000
 C                  1.29850000    1.15530000    0.08660000
 H                  1.54700000    2.20650000    0.17480000
 N                 -0.38040000   -0.51190000   -0.17080000
--
0 1
 O                 -3.40280000   -0.76860000    0.18830000
 H                 -3.69280000    0.12960000    0.00530000
 H                 -2.44560000   -0.75330000    0.02360000
}
set {
    scf_type DF
    freeze_core True
    basis def2-tzvpp
}
 
energy('sapt2+(3)dmp2')

用24核心执行计算：

psi4 dimer-altaN.com dimer-altaN.log -n 24

结果：

  Total SAPT2+(3)dMP2              -8.23952745 [mEh]      -5.17038154 [kcal/mol]     -21.63287635 [kJ/mol]

Zn-结合片段的QM几何优化

N-甲基三氮唑-Zn的3D结构（图25-左）是用Flare从PDB 6GBX的结合位点里截取出来，然后对副本进行修改得到N-甲基咪唑-Zn的3D结构（图25-右）。

QPCTL抑制剂SEN177的骨架跃迁及结合模式探讨-墨灵格的博客

图25. N-甲基三氮唑-Zn(左)与N-甲基咪唑-Zn（右）的3D结构

几何优化使用Gaussian 16 A.01在APFD/6-311+G(d,p)理论水平下进行，其中N-甲基三氮唑-Zn的几何优化输入文件如下：

1
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6
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%chk=triazole_opt.chk
# opt apfd/6-311+g(d,p)
 
Structure: 6GBX-Ligand Triazole-Zn complex; Job: Opt at APFD/6-311+G(2d,p) level
 
2 1
 C                                                    24.49500000    5.16500000   34.26200000
 N                                                    23.02600000    4.82000000   34.44200000
 C                                                    22.36500000    3.80600000   33.86200000
 N                                                    21.11200000    3.88000000   34.24600000
 N                                                    20.93900000    4.92800000   35.07000000
 C                                                    22.13800000    5.52500000   35.15600000
 H                                                    24.96100000    4.41800000   33.78800000
 H                                                    24.58200000    5.99900000   33.71800000
 H                                                    24.90900000    5.30500000   35.16100000
 H                                                    22.75600000    3.11900000   33.24900000
 H                                                    22.42790000    6.35120000   35.63910000
 Zn(PDBName=ZN,ResName=ZN,ResNum=401_A)               19.56200000    2.58500000   34.19800000
 
!a blank line

其中N-甲基咪唑-Zn的几何优化输入文件如下：

1
2
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6
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20
21

%chk=imidazole_opt.chk
# opt apfd/6-311+g(d,p)
 
Structure: 6GBX-Ligand Imidazole-Zn complex Job: Opt at APFD/6-311+G(d,p) level
 
2 1
 C                                                    24.49500000    5.16500000   34.26200000
 N                                                    23.02600000    4.82000000   34.44200000
 C                                                    22.36500000    3.80600000   33.86200000
 N                                                    21.11200000    3.88000000   34.24600000
 C                                                    22.13800000    5.52500000   35.15600000
 H                                                    24.96100000    4.41800000   33.78800000
 H                                                    24.58200000    5.99900000   33.71800000
 H                                                    24.90900000    5.30500000   35.16100000
 H                                                    22.75600000    3.11900000   33.24900000
 H                                                    22.42790000    6.35120000   35.63910000
 Zn(PDBName=ZN,ResName=ZN,ResNum=401_A)               19.56200000    2.58500000   34.19800000
 C                                                    20.93900000    4.92800000   35.07000000
 H                                                    20.06349907    5.27751199   35.57620103
 
!a blank line

N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑、咪唑等结合片段与Zn的相互作用能分析

在BP86-D3/DEF2-TZVP理论水平下对N-甲基三氮唑、N-甲基咪唑、与咪唑进行几何优化，然后在Flare里叠合到PDB 6GBX共晶配体SEN177的N-甲基三氮唑上，然后使用PSI49,10实现的对称匹配微扰理论(SAPT)方法在sapt2+(3)dmp2/def2-tzvpp水平下计算模型分子与Zn之间的相互作用能。

N-甲基三氮唑-Zn（图19-左）的相互作用能计算：

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26

memory    24 GB
 
molecule dimer {
0  1
C          24.45970         5.14230        34.28400
N          23.05170         4.85230        34.41360
C          22.35590         3.82100        33.86740
N          21.10810         3.85120        34.24470
N          20.96170         4.93210        35.07230
C          22.12720         5.51020        35.16090
H          24.80910         4.81980        33.30360
H          24.61970         6.21680        34.36970
H          25.03920         4.63170        35.05590
H          22.79990         3.09130        33.20730
H          22.35250         6.39490        35.73710
--
2 1
Zn         19.562           2.585          34.198
}
set {
    scf_type DF
    freeze_core True
    basis def2-tzvpp
}
 
energy('sapt2+(3)dmp2')

结果：

  Total SAPT2+(3)dMP2              -163.63803595 [kcal/mol]

N-甲基咪唑-Zn（图19-右）的相互作用能计算：

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27

memory    24 GB
 
molecule dimer {
0 1
C          24.46620         5.14310        34.26600
N          23.03840         4.83050        34.42980
C          22.39560         3.82700        33.86210
N          21.09780         3.87040        34.25410
C          22.15850         5.55110        35.20930
C          20.94250         4.96280        35.10930
H          24.91810         4.41230        33.59780
H          24.55860         6.14210        33.83930
H          24.94780         5.09920        35.24310
H          22.84540         3.10290        33.19890
H          22.46690         6.42150        35.77070
H          20.00530         5.23460        35.57120
--
2 1
Zn         19.562           2.585          34.198
}
set {
    scf_type DF
    freeze_core True
    basis def2-tzvpp
}
 
energy('sapt2+(3)dmp2')

结果：

  Total SAPT2+(3)dMP2              -174.85693784 [kcal/mol]

咪唑-Zn的相互作用能计算：

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memory    24 GB
 
molecule dimer {
0  1
N          23.03830         4.82900        34.44550
C          22.34030         3.81130        33.87250
N          21.07890         3.83430        34.22110
C          20.95140         4.91360        35.05600
C          22.15390         5.54860        35.21140
H          22.80290         3.08950        33.21520
H          22.45410         6.41580        35.77690
H          20.00160         5.17370        35.49910
H          24.01930         5.02280        34.32740
--
2 1
Zn         19.562           2.585          34.198
}
set {
    scf_type DF
    freeze_core True
    basis def2-tzvpp
}
 
energy('sapt2+(3)dmp2')

结果：

  Total SAPT2+(3)dMP2              -158.93980024 [kcal/mol]

结论

在本文中，用QPCT/SEN177共晶结构PDB 6GBX代理QPCTL/SEN177结合模型，用GIST方法分析了apo结合位点，发现两个重要的结合水。然后根据Unhappy water规划了Spark水分子替换策略对SEN177的吡啶母核进行生物等排体替换，重现了经过文献验证过的QP5020设计。这证明了我们的方法能够替换Unhappy桥连水分子并正确的识别出4-腈基苯片段做为吡啶母核的替换结构。

此外，还根据Happy water提出了SEN177可能的新结合模式，这个结合模式可以解释文献报道系列化合物的SAR，同时还可以用MM/GBSA对已知化合物进行排序、分类。新的结合模式可以用来指导侧链吡啶的生物等排体替换。

最后，还对三氮唑片段进行生物等排体替换实验，打分最高排名第3的N-甲基咪唑具有最佳的Zn结合几何模式，并被文献报道的QP5038所验证。Spark还命中尚未有文献报道的新化学骨架类型，有望发展出新的系列化合物。

参考文献

  1. Logtenberg, M.E.W., Jansen, J.H.M., Raaben, M. et al. (2019). Glutaminyl cyclase is an enzymatic modifier of the CD47- SIRPα axis and a target for cancer immunotherapy. Nat Med 25, 612–619. https://doi.org/10.1038/s41591-019-0356-z
  2. Wu, Z., Weng, L., Zhang, T. et al. (2019). Identification of Glutaminyl Cyclase isoenzyme isoQC as a regulator of SIRPα-CD47 axis. Cell Res 29, 502–505. https://doi.org/10.1038/s41422-019-0177-0
  3. Barreira da Silva, R., Leitao, R.M., Pechuan-Jorge, X. et al. (2022). Loss of the intracellular enzyme QPCTL limits chemokine function and reshapes myeloid infiltration to augment tumor immunity. Nat Immunol 23, 568–580. https://doi.org/10.1038/s41590-022-01153-x
  4. Yu, L., Zhao, P., Sun, Y., Zheng, Z., Du, W., Zhang, L., Li, Y., Xie, L., Xu, S., & Wang, P. (2023). Development of a potent benzonitrile-based inhibitor of glutaminyl-peptide cyclotransferase-like protein (QPCTL) with antitumor efficacy. In Signal Transduction and Targeted Therapy (Vol. 8, Issue 1). Springer Nature. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01715-x
  5. 肖高铿与徐锡明的私人微信通信. 2021年8月25日.
    6. QPCTL抑制剂SEN177的骨架跃迁及结合模式探讨-墨灵格的博客
  6. Spark V10.7. https://www.cresset-group.com/software/spark
  7. Flare V8.0. https://www.cresset-group.com/software/flare
  8. Baumgartner, M. P.; Evans, D. A. (2020). Side Chain Virtual Screening of Matched Molecular Pairs: A PDB-Wide and ChEMBL-Wide Analysis. J. Comput. Aided. Mol. Des. 2020, 34 (9), 953–963. https://doi.org/10.1007/s10822-020-00313-1.
  9. Turney, J.M., Simmonett, A.C., Parrish, R.M., Hohenstein, E.G., Evangelista, F.A., Fermann, J.T., Mintz, B.J., Burns, L.A., Wilke, J.J., Abrams, M.L., Russ, N.J., Leininger, M.L., Janssen, C.L., Seidl, E.T., Allen, W.D., Schaefer, H.F., King, R.A., Valeev, E.F., Sherrill, C.D. and Crawford, T.D. (2012). Psi4: an open-source ab initio electronic structure program. WIREs Comput Mol Sci, 2: 556-565. https://doi.org/10.1002/wcms.93
  10. PSI4 V1.9. https://psicode.org
  11. Pozzi, C., Di Pisa, F., Benvenuti, M. et al. (2018). The structure of the human glutaminyl cyclase–SEN177 complex indicates routes for developing new potent inhibitors as possible agents for the treatment of neurological disorders. J Biol Inorg Chem. 23, 1219–1226. https://doi.org/10.1007/s00775-018-1605-1

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