摘要：需要不需要对线型先导物进行构象约束以获得更好的衍生物？这是药物化学工作者常常面临的一个问题。最直接的做法是合成出化合物，再去用SPR等动力学实验、ITC等热力学实验来确认是否构象约束达到预期效果。但是合成这些化合物通常并非易事。Freeform可以帮你在合成前采用计算方式评估这种构象约束是否值得一做，然后再决定是否去合成。本文介绍了FreeForm的基本原理、与传统方法相比的优势以及应用实例。

作者：肖高铿
联系：gkxiao@molcalx.com

一.构象（生物活性构象）稳定性与药物化学

将一个长链的先导物(lead)进行构象约束后获得的构象约束衍生物（constrained analog）是药物化学里常用来提高化合物活性的手段。然后，并非每个构象约束的衍生物都能达到预期效果，因此对药物化学科研人员而言，就需要在合成化合物前做出决策：是否值得对先导物进行构象约束？

因为构象约束意味着结构改造，通常需要用到成环的反应，很多时候并非易事。比如图1所示，Ezzili（2011）从Fatty Acid Amide Hydrolase(FAAH)抑制剂先导物出发，采用构象约束策略设计了衍生物。

图1，FAAH抑制剂：左边为先导物，右边为构象约束衍生物

因此在合成右边的构象约束衍生物之前需要思考两个问题：

1. 柔性的构象应该约束吗？
2. 结合构象是否稳定？

化合物结合构象稳定性常采用化合物的构象能（Strain Energy）来评价：通常采用以全局最低能构象为参比，以构象的相对能量值来评估，如图2所示。

图2. 传统的Strain Energy：以全局极小构象为参比，评估结合构象的稳定性。

传统化合物Strain Energy很明显存在的问题：只考虑了活性构象与全局极小点，并忽略了熵的变化。而配体分子与靶点结合时真实的情况却是：在溶剂中从非结合的构象系综变为与蛋白结合口袋中一个特定的生物活性构象,如图3所示。

图3，配体分子与靶点结合的构象变化：从溶剂非结合构象系综变为到生物活性构象

传统的Strain Energy虽然直观且容易凭经验用目测构象即可比较高低，但存在上述的缺陷常常不能正确评估构象稳定性。因此我们需要一个更合适的Strain Energy计算方法。

二.FreeForm：生物活性构象的Strain Energy计算

1. FreeForm简介

Freeform是OpenEye药物设计软件包的一个应用，可以用来计算化合物的溶剂化自由能以及计算化合物从一个构象系综变为一个生物活性构象或其它单一构象的自由能，如图4所示。

图4，FreeForm计算构象自由能不仅考虑了配体的非结合构象系综，还考虑了主要的熵成分

2. FreeForm的使用

假设你有一个化合物的生物活性构象：sitagliptin.mol2, freeform可以计算其生物活性构象的Global Strain Energy:

1

freeform -calc conf -in sitagliptin.mol2 -track sitagliptin.mol2 -prefix sitagliptin.3D.pfn

计算结果会报告在sitagliptin.3D.pfn.pdf的文件里，打开得到类似图5的结果：

图5，sitagliptin.mol2计算结果报告

图5的计算结果报告了Global Strain Energy及其的各个成分：

3. FreeForm的应用

通过比较先导物与衍生物的Global ΔE就可以比较两者的构象稳定性，并进而判断构象约束是否值得做。

三.FreeForm用于评估构象稳定性

案例1. FAAH抑制剂的先导物是否值得进行构像约束？

还是以图1所示的Ezzili的FAAH抑制剂为例，我们分别计算线型的先导物与环约束衍生物的结合构象Strain Energy，结果如图6所示。

图6. FAAH抑制剂先导物（左边）与构象约束衍生物（右边）的Strain Energy

如图6所示，FAAH抑制剂先导物（左边）与构象约束衍生物（右边）有相似的Strain Energy, 分别为5.7与5.9, 因此构象约束衍生物比之线型的先导物来说没有优势，从这一点上讲构象约束衍生物不值得去合成。实际上，线型先导物与构象约束衍生物的Ki值分别为4.7nM与4.4nM（Ezzili, 2011），构象约束衍生物比其先导物并无显著的生物活性优势，与计算结果一致！

案例2. BACE抑制剂的环化

Ellen W. Baxter等人（2007）高通量筛选发现了BACE-1抑制剂（Ki=900nM）,X-ray结果显示发现这类化合物在结合位点折叠为发夹状，如图7所示。

图7. BACE-1抑制剂先导物（左边）及其结合构象（右边）

这提示，设计发夹型的化合物或许能提供化合物的活性，图8的左边那个化合物就是为了强化发夹型结构而设计，结果活性提高到Ki=158nM。

Huang Yifang等人(2010)从该发夹型结构获得提示：将化合物的两个末端连接起来生成大环结构或许提高化合物的活性。那我们现在就用FreeForm来看看是否值得去制备这个大环衍生物，如图8所示。

图8. BACE-1抑制剂发夹结构衍生物（左边）及其环化衍生物（右边）

图9总结了先导物与大环化合物的计算结果，我们可以发现：大环分子的构象自由能(relaxed bioactive conformer)稍微不占优势;但是local ΔH绝对优势，主要因为发夹型化合物需要花能量将化合物折叠起来。总的结果是大环分子的Global Strain Energy比先导物要低了大约5kcal/mol(一倍多)。由此可以预测：大环化合物比起先导物可能活性提高一倍，值得一试！

图9. BACE-1抑制剂先导物及其环化衍生物的构象稳定性

实验结果表明，大环衍生物的生物活性要比发夹型先导物高出一倍，大环化合物与发夹型先导物的Ki值分别为60nM(Huang 2010)与158nM(Baxter 2007), 虽然与计算不能定量相关，但是非常一致，如下表所示。

四. 总结

1. 传统Strain Energy采用全局最低能构象作为参比，虽然很直观，但很多时候没有什么用；
2. 真正的参比应该是溶液中的构象系综，并不直观，需要计算才能知道；
3. 构象自由能是对药物化合物科研人员来说是更合理的指标；
4. FreeForm的Strain Energy包含了构象自由能的主要成分，为药物化学科研人员提供更好的指导作用;
5. 分子对接虚拟筛选的假阳性主要来源之一是构象的能量可及性问题，与构象稳定是一回事，因此也适合于分子对接pose的评估

五. 文献

Baxter, E. W., et al. (2007). "2-Amino-3,4-dihydroquinazolines as Inhibitors of BACE-1 (β-Site APP Cleaving Enzyme):  Use of Structure Based Design to Convert a Micromolar Hit into a Nanomolar Lead." Journal of Medicinal Chemistry 50(18): 4261-4264.

Huang, Y., et al. (2010). "Macrocyclic BACE inhibitors: Optimization of a micromolar hit to nanomolar leads." Bioorg Med Chem Lett 20(10): 3158-3160.

Ezzili, C., et al. (2011). "Reversible Competitive α-Ketoheterocycle Inhibitors of Fatty Acid Amide Hydrolase Containing Additional Conformational Constraints in the Acyl Side Chain: Orally Active, Long-Acting Analgesics." Journal of Medicinal Chemistry 54(8): 2805-2822. DOI:10.1021/jm101597x

联系我们，获取软件试用