摘要：本教程演示了Flare的对接计算流程，包括：1）PDB文件下载；2）受体、配体结构准备；3）配体的导入；4）分子对接计算；5）结果分析与可视化。

一. 背景介绍

BCR-ABL激酶是抗白血病药物伊马替尼(Imatinib)的作用靶点，复合物晶体结构的PDB代码为1IEP。本教程将从伊马替尼的SMILES代码出发，进行对接计算，以演示如何用FLARE进行分子对接、结合模式预测。

Figure 1. 伊马替尼的结构

Flare采用分子对接软件Lead Finder作为计算引擎, 在同样的数据集上Lead Finder展示出比同行们更好的分子对接计算精度（见表1）。借助于Flare优秀的分子结构准备功能，使得Flare版的Lead Finder的性能优于Lead Finder。

Table 1. Lead Finder的对接计算精度（redocking）

Lead Finder分子对接计算精度

数据源自: http://biomoltech.com/science/benchmarking/docking_success_rate

Flare/leadfinder分子对接技术流程如下图所示：

Lead Finder虚拟筛选流程

其中，第一步是从原始蛋白3D结构出发得到优化的蛋白模型，是由LeadFinder的build_model模块在后台完成，对应于第三节的蛋白结构准备。第二步energy grid map生成是由Leadfinder完成，第三节的参数设定中的grid define就是定义结合位点（结合口袋）的位置以计算格点。格点文件包含了蛋白结合位点的全部信息，在分子对接计算中就是用格点代表蛋白。格点文件可以重复使用，对接不同的配体到同一个结合位点就可以用同一个格点文件。有了格点与准备好的配体结构，就可以开始分子对接计算。分子对接是将指定的配体对接到代表蛋白的格点上，并给出pose与打分值。

二. 准备工作

  1. 安装了Flare
  2. 电脑可以上网，以便下载PDB文件(1IEP)
  3. 准备好伊马替尼的结构文件，比如SMILES、Mol、SDF或Mol2格式文件。你也可以从这里下载一个SMILES格式文件：imatinib.smi

    4. 化合物结构准备，或化合物库准备方法可以参考：http://blog.molcalx.com.cn/2017/06/05/tutorial-chemistry-library.html

三. 分子对接计算

  1. 下载PDB文件，准备蛋白结构

    2. (1)File | Download PDB

    (2)在PDB codes行键入1IEP，点击OK按钮，开始下载PDB结构。

    下载完毕，会弹出Open Molecules对话框，确保Protonation state行为Do full preparation on proteins and ligands，点击Open按钮，会弹出Flare protein preparation对话框。

    Flare protein preparation

    Figure 2. Flare protein preparation

    在Cap Chains, Auto-extract ligand打钩；并将Active site size设置为6埃。然后点击Start按钮开始准备蛋白结构。

    Flare protein preparation: Finished

    Figure 3. Flare结构准备结束。在本例中，ligand表单含有两个配体，分别来自Chain A的A STI 201与来自Chain B的B STI 202;Protein表单含有套结构一个为1IEP，另一个为1IEP_P。其中1IEP为原始下载的结构文件，而1IEP_P为Flare准备好的文件。

    (3)表单的编辑：删除Chain B的小分子、蛋白、水以及其他。

    按住Shift键，在Protein表单的1IEP_P下用鼠标分别点击B Chain，B Other与B Waters，则选中蛋白B链的全部内容；单击鼠标右键，选Delete，删除选中的内容。

    Flare Protein table： Edit

    Figure 4. 删除Chain B的内容：蛋白，其他以及水

    采用类似的操作，可以删除Ligand表单中的配体B STI 202，Chain A蛋白中的四个Cl离子。

    注意：本文只是一个演示，在具体实践中要删除什么、保留什么需要根据您具体的研究内容而定。

  2. 导入待对接的化合物到Ligand表单中

    3. File | Open 读入imatinib.smi文件，点击Open，会弹出Open Molecules对话框。对话框的Molecule Type设置为Ligands；其它部分采用默认值，点击Open。结构准备完毕，在Ligand表单会新增一个分子Imatinib/Gleevec,我们要将这个分子docking到蛋白口袋里。

  3. 分子对接

    4. (1) 打开对接对话框

    Flare docking 01

    Figure 5. Flare分子对接

    在Ligand表单里点击待对接化合物，再点击Ligand菜单里的Dock Ligands命令(Figure 5)打开分子对接计算对话框，见Figure 6。

    (2)参数设定

    这部分分为两个子任务：生成分子对接的格点文件与分子对接计算。分子对接格点需要定义对接计算的结合位点在哪里，有三种方式：从结合位点里选一个原子来指示结合位点；用结合的配体指示结合位点；用计算现成的格点。

    Flare docking calculation

    Figure 6. Flare分子对接参数设定

    在Flare docking calculation对话框里，设置参数如下：

    Calculation method：Normal

    Calculation method设置计算模式：quick,normal,accurate but slow, score only。根据不同的目的选择不同的模式。

    Ligands to dock: selected ligands

    Undocked ligands: 所有未对接过的分子都会被进行计算；Selected ligands:仅是那些被选中的化合物会被进行对接计算。

    Grid Definition: Ligand | A STI 201

    本计算中我们用共晶的配体(bound ligand)来定义结合位点、计算格点。Lead Finder用预先生成的GRID文件对pose进行打分，因此需要在对接前准备好GRID文件。准备GRID文件最重要的一点是定义分子对接的结合位点在哪里，可以通过复合物结构里的配体来定义（ligand），还可以选择一个或多个原子来定义（选择Atom pick，然后再3D视窗区用鼠标选择活性位点内的一个原子或几个原子）。

    Protein: 1IEP_P

    并将A Chain与A Waters打钩，意思是蛋白与水都设为蛋白。如果不想把水看作为蛋白的一部分，则将water处不要打勾。注意：本文只是演示Flare对接的功能与选项的作用，并不是推荐默认将水设定为蛋白的一部分。

    其它选项：Show options

    一般情况下，不需要对show options进行设置,采用默认的预设值就可以。但是，有时候准备的配体初始结构不理想，则需要通过show options的设置来提高计算精度。比如，对化合物进行优化；允许所有的酰胺键、酯键、共轭单键进行旋转。

    show options

    一般情况下，酰胺键是反式的，所以不对酰胺键进行旋转。如果不能确认初始的构象是否合理，可以全部打钩。注意，最后一项的共轭键是指共轭单键（比如甲氧基苯的的氧原子与苯环的共轭），如果你对初始构象不了解，建议选All。尤其是ChemOffice的用户画的酰胺3D结构经常有顺势结构，所以建议ChemOffce/Chem3D用户将所有可选项都打钩、并且共轭键旋转选择All。

    (3)开始分子对接计算

    点击Start按钮,开始计算。分子对接计算分两个子任务：格点计算与分子对接。格点计算耗时较长，但无需重复计算。计算结束会在ligand表单出现一个新的分子，其名称为待对接化合物加上copy。

四.对接结果可视化与分析

对接的结果保存在配体表单里。

Flare post Dock

Figure 7. 对接结果的可视化与分析

1. Pose的操作

点击任意一个对接后配体左边的小箭头(Figure 7 图标1)可以展示保存的pose。通过键盘的上、下键可以滚动浏览对接的pose，也可以用鼠标选中pose。点击单选按钮(Figure 7 图标2)可以收藏喜欢的pose。

Ligand表单里的Protein列给出当前docking计算是跟哪个蛋白进行的，将pose与蛋白关联起来。

2. 配体-蛋白相互作用的展示

首先确认在Protein窗口选中对接时用的蛋白，再点击Contacts(Figure 7, 图标3)，可以展示蛋白与pose之间的相互作用：氢键、pi-pi相互做用等等（Figure 8）。

Flare Contacts

Figure 8. Contacts展示配体-蛋白相互作用类型

3. 关于对接结果的导出

对接的pose可以导出, 使用菜单： File | Export | Export Selected ligands。支持的格式包括: SDF,Mol2, PDB, XED。

4. 关于打分值

  • Rank score

    • 每个配体对接获得的pose按Rank Score值从小到大排序，也即打分最佳的靠前，Rank Score设计的意图是让对方最佳的pose最接近实验结果。

  • dG score

    • dG打分函数设计用来进行精确的评估蛋白-配体结合自由能。

  • VSscore

    • VSscore(Virtual Screening scoring)打分:该打分设计用于虚拟筛选，高效率的区分活性（高打分->true binders）与非活性化合物(打分低->Inactive ligands)。

五. 接下来可以做什么

  1. 用WaterSWAP对pose进行精确打分、排序；
  2. 用Protein Field Surface观察配体与蛋白在静电场上的关系，设计新的分子；
  3. 用静电电互补性考察分子的结构，提出结构改造方案；
  4. 用Ligandscout生成基于结构的药效团；
  5. 计算水分子的位置与稳定性，设计新的分子；
  6. 多个分子对接后，用AutoT&T进行全新分子设计。

六. 联系我们