教程 | SPARK替换结晶水分子

摘要：如何利用复合物晶体结构的水分子信息，从一个活性很弱的起始化合物出发，经过片段替换（骨架跃迁、侧链替换）大幅提高化合物的活性？本文用Cresset SAPRK软件的生物等排替换功能, 以选择性BTK(Bruton’s tyrosine kinase)抑制剂的X-衍射晶体结构为起始分子，进行水分子的替换实验以发现比初始分子活性更强的化合物。同时，试剂数据库的使用保证了链接到起始分子上的片段都是可合成的，试剂的多样性也保证了该方法的可行性。

原文： Giovanna (October 28, 2015). http://www.cresset-group.com/2015/10/displacing-crystallographic-water-molecules-with-spark

前言

BTK激酶是非受体酪氨酸激酶Tec家族成员，有文献表明Btk的抑制是诸如类风湿性关节炎之类的自免疫疾病治疗方法²，类风湿性关节炎这类进行性自免疫疾病的特点是关节的肿胀与糜烂³。

基于片段的药物设计最近成功地应用于非共价键结合的Btk抑制剂发现²，同时对Lck激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, 一种T-细胞激活的关键靶标)具有选择性。

在本次实验中，化合物2(Table 1)是最令人感兴趣的化合物，因此对之进行了结构优化。从一系列的硼酸/酯出发，用Suzuki−Miyaura合成法⁴在片段2的8位引入不同片段以便探讨噌啉环的构效关系。初步的SAR探索直接发现了化合物8(Table 1), 比之片段2它显著地提高了活性与选择性。

公开的化合物8与Btk活性位点结合的x-ray晶体结构数据(PDB 4ZLZ)表明：有一个水分子介导了吡啶环N与P-Loop骨架上Phe413以及GLY414残基之间的氢键相互作用²(Figure 1-左)。将3-取代的4-甲基吡啶片段用小的双环杂环替换这该水分子、并使得新化合物直接与P-Loop区直接发生氢键作用，结果发现了化合物10与11(Table 1)。比之起始化合物，用这个水分子替换策略设计的新化合物10与11对Btk的活性约提高了10倍。

在本文中，我们以化合物8以及桥连的水分子为起始分子用SPARK进行片段替换，目的是验证我们的方法能否替换桥连水分子并正确的识别出吲唑(indazole)片段做为替换结构。

Table 1. SAR exploration of fragment hit ²

Spark试剂数据库：化学多样性的片段库及其准备方法

SPARK用Cresset的场技术^5,6从片段数据库中识别出可以替换参比分子中被选中的那部分的骨架或侧链。在本研究中，我们用SPARK自带的标准试剂数据库⁷进行搜索、替换。这个数据库是从商品可供购买的化合物目录生成的。没有采用更大的数据库，而仅采用商品销售试剂来源的片段库确保了能够快速地完成搜索、并在指定的位置快引入R-基团。当然，SPAKR里支持自定义片段库。你可以用自己的化合物数据库生成自己的片段库并用于搜索与替换（需要License支持）。

方法

在Forge软件里下载化合物8与Btk的氟化物晶体结构（PDB 4ZLZ），优化配体，并将之与介导化合物与P-Loop氢键作用的水分子合并为一个单一分子。两个3D结构的合并可以用Forge的”combine selected pair into single molecule”功能来实现。将合并后的新结构(Figure 1-右边)作为SPARK计算的起始分子(Figure 2-左边)。

在水分子替换实验中，我们想让SPARK主要在静电场驱动下进行搜索而不是常用的静电场与形状的组合。为此，我们用SPAKR的约束编辑器给水加上了正、负场点约束(Figure 2-右边)。该约束引入了打分惩罚，与约束场点不匹配的结果将被罚分。

此外，还将SPARK搜索条件由“Normal”调整为场(Filed)90%与Shape10%，并将Btk蛋白作为硬排斥体积(excluded volume)以便将替换的片段限制在一定尺寸内。

Figure 1. Left: X-ray crystal structure of compound 8 in the active site of Btk making a water mediated hydrogen bond with the P-loop backbone. Right: 3D structures and field points of compound 8 and of the bridging water molecule combined into a single entry.
Color coding of field points: blue = negative; red = positive; yellow = steric; gold = hydrophobic.

优化的梯度截断值设为0.200kcal/mol/A, 同时将自动片段尺寸约束(Automatic constraint of fragment size)去掉以保证搜索的结果不太偏向于初始分子的大小。最后，我们将结果聚焦于双环杂环化合物，所以用用SMARTS过滤器将单环片段从结果中过滤掉。

用上述条件进行了两轮计算，第1轮实验是用含775个硼酸化合物的数据库进行片段替换试图重现文献的结果^2,4。

Figure 2. Left: the combined 3D structures of compound 8 and the bridging water molecule used as a starter molecule in the Spark experiment. Right: constraints associated to the field points of the water molecule.
Color coding of field points: blue = negative; red = positive; yellow = steric; gold = hydrophobic.

在第2轮实验里，假设硼酸及其酯可以用相关的卤代芳香化合物进一步合成而得，因此我们采用ZINC7数据库的卤代芳香化合物(41000片段)进行SPARK的片段替换搜索。

结果

第1轮搜索到的打分最高的化合物是化合物10(Table 1)，Figure 3（右）展示了该化合物与初始化合物的叠合效果，约束的场点匹配的相当好。化合物11预期其应该与化合物8的邻-甲基-吡啶-基团构象叠合的很好，然而在本次搜索中没有命中，主要是因为本轮筛选所用数据库的化学多样性有限。

在第2轮SPARK搜索中，所用的试剂数据库（硼酸与卤代芳香化合物）比第1轮要大的多，化合物11(Figure 3中间，Figure 4)是打分最高的化合物，化合物10排在第4(Figure 4)。

原文²同时还报道了吲哚化合物9(Table 1),该化合物在2D结构上与活性强的多的化合物10、11很相似。这个片段在两个数据库里都有，但是SPARK并没有把它搜出来。实际上，吲哚片段不能与桥联水分子的负电场点匹配，如Figure 5所示，展示了化合物9与起始化合物的叠合效果，缺少了左上角的负点场点。这可以解释为什么化合物9比起化合物10、11的活性低了那么多，Btk的IC₅₀=850nM (Table 1)。

Figure 4用磁贴视图展示了第2轮SPRK搜索命中的打分最高的16个结果。其中就有几个不同取代吲唑片段，还有双环片段也被推荐出来，这些都为进一步设计Btk抑制剂提供了非常有用的信息。

Figure 3. Left: electrostatics of starter molecule. Center: compound 11 (Btk IC50 = 4.0 nM). Right: compound 10 (Btk IC50 = 12 nM)
Color coding of fields/field points: blue = negative; red = positive; yellow = steric; gold = hydrophobic.

Figure 4. Tile view of the top scoring Spark results for the second experiment.

Figure 5. Compound 9 (right) superimposed to the starter molecule of the Spark experiment (left).

结论

在本研究中，SPARK成功地将桥连化合物8与Btk激酶P-Loop的结晶水分子用小的、合成可行的双环杂环片段替换，设计出活性更高的化合物。

拥有合适来源、具有结构多样性的片段数据库依然是生物等排替换成功的决定性因素。鉴于这个理由，大力推荐用公司自用的数据库创建片段库、并用于SPARK的片段搜索，既保证化合物的可合成、还对来源可控。

关于水分子的计算

本研究的关键之一是利用了一个可以被替换的水分子，问题是：如何知道结合口袋中的哪些水是可以被替换、哪些不可以呢？Flare的3D-RISM与OpenEye的SZMAP是专业的水分子位置与稳定性预测软件，通过它们，可以帮你快速识别可替换水分子。Figure 6是用Flare的3D-RISM分析4ZLZ配体结合位点的结果，Water A954被明确的标示为unhappy water，意味着是可替换水。

Figure 6. FLARE对4ZLZ A链进行3D-RISM分析。结果表明，水分子A954被标示为Unhappy Water。详细计算流程见3D-RISM预测水分子位置教程⁹。

新版SPARK与Flare结合使用更方便

参见博文：SPARK水分子替换（Flare版）

参考文献

1. http://www.cresset-group.com/products/spark
2. Smith, C. R.; Dougan, D. R.; Komandla, M.; Kanouni, T.; Knight, B.; Lawson, J. D.; Sabat, M.; Taylor, E. R.; Vu, P.; Wyrick, C. Fragment-Based Discovery of a Small Molecule Inhibitor of Bruton’S Tyrosine Kinase. J. Med. Chem. 2015, 58 (14), 5437–5444.
3. Firestein, G. S. Evolving Concepts of Rheumatoid Arthritis. Nature 2003, 423 (6937), 356–361.
4. Miyaura, N., Suzuki, A. et. al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111 (1), 314−321.
5. Molecular Field Extrema as Descriptors of Biological Activity: Definition and Validation. J Chem Inf Model 2006, 46 (2), 665–676.
6. http://www.cresset-group.com/science/field-technology
7. Spark fragment databases come from commercial compounds, ChEMBL, ZINC and VEHICLe.
8. http://www.cresset-group.com/products/forge
9. 3D-RISM预测水分子的位置与稳定性. http://blog.molcalx.com.cn/2017/06/18/flare-3d-rism-tutorial.html